培养细胞之死活细胞的鉴别实验报告

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1、生物化学实验报告姓名于佳喜学号201300140120学院生命科学学院年级2013级生物基地班培养细胞之死活细胞的鉴别7/7一、实验目的1.1学习并掌握动物细胞培养的无菌操作技术。 1.2了解并掌握用组织块贴壁培养法和消化细胞培养法进行动物细胞原代培养的实验方法。 1.3熟练掌握动物细胞传代培养的实验方法。1.4学习细胞生死状态鉴别的方法。1.5了解细胞生死状态鉴别的原理。 1.6熟悉和掌握各种鉴别细胞生死状态方法的判定特征。 1.7掌握细胞技术方法，计算细胞存活率二、实验原理细胞培养指的是在无菌条件下，把动、植物细胞从组织中取出，在体外模拟体内的生理环境，使离体的细胞在体外生长和

2、繁殖，并且维持其结构和功能的一种培养技术 细胞生死状态的鉴别方法主要是化学染色法和荧光染色法。 活细胞和死亡细胞在生理技能和性质上主要存在一下差异：① 细胞膜通透性的差异：活细胞的细胞膜是一种选择性膜，对细胞起保护和屏障作用，只允许物质选择性地通过；而细胞死后，细胞膜受损，其通透性增加。基于此，发展出了以台盼蓝、伊红、苯胺黑、赤藓红、甲基蓝以及荧光染料碘化丙啶或溴化乙啶等为染料鉴别细胞生死状态的方法，上述染料能使死亡细胞着色，而活细胞不被着色。此外，应用植物质壁分离的性质也可鉴定植物细胞的生死状态。活细胞的原生质具有选择透过性，死细胞因其原生质的选择透过性已遭破坏，故与高渗透压溶液

3、接触时不产生质壁分离。② 代谢上的差异：活细胞中新陈代谢作用强，细胞内的酶具有较强的活性和还原能力。基于此，发展处了以荧光素二乙酸酯（FDA）、荧光素二丙酸酯、荧光素二丁酸酯或荧光素二苯甲酰酯等酯化的荧光素鉴别细胞生死状态的方法，上述酯化的荧光素亲脂性提高，容易被细胞吸收进入，活细胞内的酯酶具有较强的活性，可将酯化的荧光素分解而释放出能发荧光的荧光素，该物质不能自由透过活的细胞膜，积累在细胞内，荧光显微镜下显示有明亮的绿色或黄绿色荧光；而死亡细胞内的酯酶因失去活性，不能分解酯化的荧光素，荧光显微镜下显示不发光。另外，可用亚甲基蓝为染料鉴定酵母细胞的生死状态。亚甲基蓝是一无毒染料，氧

4、化型为蓝色，还原型为无色。活细胞因具有较强的还原能力，能使亚甲蓝从蓝色的氧化型变成无色的还原型，故活的酵母细胞在用亚甲基蓝染色后显示无色；死亡酵母细胞或代谢缓慢的衰老酵母细胞，因无还原能力或还原能力极弱，使亚甲蓝仍处于氧化态，故呈现蓝色或淡蓝色。三、实验器材3.1 7/7器材：解剖剪、解剖镊、培养皿、纱布块、试管、锥形瓶、吸管、橡皮头、L型注射器、离心管等。上述器材需彻底洗净、烤干、包装好，灭菌，备用。 超净工作台、CO2培养箱、普通光学显微镜、离心机、血球计数板、酒精灯、酒精棉球、试管架、记号笔、解剖板、盖玻片等。 3.2试剂：培养液、PBS液 0.4%台盼蓝染液3.3材料：小白

5、鼠四、操作步骤4. 1取材 取小白鼠一只，采用断头法处死：清水洗小鼠并浸于75%酒精中灭菌3分钟。取出转入超净工作台内的解剖盘内，无菌操作打开腹腔。取出脾脏，去除其周围的脂肪组织，镊起脾脏用PBS液自上而下冲洗1—2次。转入无菌玻璃培养皿，待用。 4.2 分离脾细胞 4.2.1用滴管先向上述无菌玻璃培养皿中滴入PBS液30滴，再用“L”型针头注射器在皿中吸取PBS液0.2ml，然后将其沿脾长轴方向注射入脾内（使脾脏膨胀以利于细胞散开）。 4.2.2用针尖在脾脏上扎眼，并用“L”针头轻刮脾脏表面挤出脾细胞，用滴管吸皿中的PBS液冲脾脏并吹散刮出的脾细胞，稍倾斜并静置1—2分钟。 4.

6、2.3吸取上述静置后的脾细胞悬液上清部分放入Eppendorf发管，并使量至1ml，以3000r/分离1—2分钟。 4.3 培养脾细胞 4.3.1超净工作台中取塑料培养皿一个，用移液枪（1000μl）加入细胞培养液2ml，并在皿盖上画上标记，待用。4.3.2 取上述离心后的Eppendorf管，在超净工作台内开盖弃去上清液，用移液枪（200μl）吸取塑料皿中的培养液400ml加入弃去上清液的Eppendorf管中，用枪头吹匀管底的脾细胞，然后吸取200ml脾细胞悬液接种于上述塑料培养皿中，混匀，然后放入37℃、5%二氧化碳培养箱中培养。 4.4 台盼蓝法鉴定细胞的生死状态： 4.4

7、.1试剂配制：用生理盐水配置0.4%台盼蓝染液，备用。4.4.2染色计数：取0.5ml细胞悬液放于干净的试管中，加1-2滴（约0.1ml）染液，混合2-5min，滴加少许染色后的细胞悬液于放有盖片的血球计数板的斜面上，使悬液自然充满计数板小室。注意不要使小室内有气泡产生，否则要重新滴加。在普通光镜10倍物镜下计数四个大格内的细胞数，压线者数上不数下，数左不数右。 4.4.3根据染色结果计算活细胞率：依据死细胞染成蓝色、活细胞不着色的原则计数死细胞数和细胞总数，以如下公