高、低淋巴道转移能力小鼠肝癌细胞株抑制性消减杂交文库的构建论文

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1、高、低淋巴道转移能力小鼠肝癌细胞株抑制性消减杂交文库的构建论文崔晓楠，唐建武，侯力，宋波，班丽英【摘要】应用抑制性消减杂交(suppressionsubtractedhybridization，SSH)技术，分别构建2个不同淋巴道转移能力小鼠肝癌细胞株的SSH文库，高转移文库以高转移能力细胞株Hca-F为检测子（tester）.freell细胞悬液）的剂量分别接种于30只615小鼠的足垫部皮下，于荷瘤28天后处死动物，取出局部瘤和引流淋巴结，石蜡包埋后进行常规HE染色，观察其淋巴结转移率。1.3Hca-P和Hca-F细胞总RNA的提取采用TRIZOLTM(GIBCOBRL

2、公司)试剂，分别提取Hca-P和Hca-F第二代培养细胞（各量约107个）总RNA，应用oligotexmRNAspincolumnpurificationkit(Qiagen公司)从两细胞株总RNA中分离mRNA。操作依照说明进行。经琼脂糖凝胶电泳及紫外分光光度计鉴定质量及纯度。1.4dscDNA合成及限制性内切酶RsaⅠ消化分别以Hca-P和Hca-FmRNA(2μｇ)为模板合成dscDNA；Chromaspin-400columns(Clontech，USA)纯化产物，限制性内切酶RsaⅠ消化dscDNA。1.5抑制性消减杂交(SSH)高转移文库以Hca-FdscD

3、NA作为tester，以Hca-PdscDNA作为driver；低转移文库以Hca-PdscDNA作为tester，以Hca-FdscDNA作为driver。采用PCRselectTMcDNAsubtractionkit(Clontech公司)进行tester与driver之间的SSH，实验依照说明书进行。①2个文库testerdscDNA6倍稀释，取等量分别与接头1、2连接；连接产物分别以G3PDH3′primer,PCRprimer1及G3PDH3′primer,G3PDH5′primer为引物，检测连接效率。②连有接头1、2的tester分别加入过量的driverc

4、DNA68℃杂交8h，再合并2份杂交产物并加入新鲜变性的过量的drivercDNA68℃杂交16h。杂交产物经过LATaqDNA聚合酶补平末端后，以试剂盒提供的PCRPrimer1作为第一次PCR的引物，以NestedPrimer1和NestedPrimer2R作为第二次PCR的引物，通过抑制性PCR富集差异表达基因的cDNA。1.6消减效率分析分别以消减产物及未消减样品为模板扩增看家基因G3PDH（特异引物序列5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′;5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′）：94℃30ｓ、60℃30ｓ、72℃2ｍｉｎ，于第18

5、、25、28、33个循环时各取PCR产物5μｌ电泳，分析消减效率。1.7消减杂交文库的建立及转化重组子的鉴定取SSH获得的差异cDNA片段特异性PCR产物2μl与pTAdv载体(CLONTECH公司)50ng连接，转化大肠杆菌DH5α，建立消减cDNA文库，依照克隆试剂盒推荐程序操作。取300μｌ菌液接种于含50μｇ/ｍｌ氨苄青霉素的LB/x-gal/IPTG琼脂板上，37℃孵育20ｈ，蓝白筛选阳性重组子,应用差异cDNA片段接头序列的巢式引物进行PCR扩增鉴定重组质粒，1%琼脂糖凝胶电泳检测是否有插入片段及其大小。1.8信息学分析2个文库各随机选取15个具有插入片段阳性

6、克隆进行扩增、质粒纯化、M13反向引物或T7启动子引物的延伸反应，然后用ABIPRISM377DNA自动测序仪测序。去除载体序列和巢式PCR引物序列，即为目的基因的序列，利用GenBank数据库进行同源性比较分析(.ncbi.hlm.nih.gov/BLAST/)。2结果2.1成瘤率及淋巴结转移率Hca-P和Hca-F细胞种植瘤于接种后7天便可触及；28天后Hca-P细胞荷瘤鼠区域淋巴结转移率10%（3/30），Hca-F细胞荷瘤鼠区域淋巴结转移率为80%（24/30），各自具有差别稳定的淋巴结转移能力。2．2RNA和mRNA的定性分析1％琼脂糖凝胶电泳检测表明，所提取的

7、TotalRNA有清晰的28S和18S的条带，且28S∶18S2∶1，表明RNA没有降解；吸光度A260/吸光度A280为1.9，证明TotalRNA的纯度优良。所获mRNA为分子量大小不等的云雾状阴影，说明提取的mRNA质优量足。2.3dscDNARsaⅠ的酶切结果Hca-P和Hca-F细胞的cDNA与RsaⅠ酶切后的Hca-F和Hca-P细胞的cDNA在1％琼脂糖凝胶上同时电泳，酶切后的cDNA片段明显小于酶切前的cDNA片段。2.4连接效率的分析高转移文库中条带1、3强度大于条带2、4强度的1/4；低转移文库中条带5、7