dsrna和rna干扰技术

《dsrna和rna干扰技术》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、dsRNA和RNA干扰技术综述***审校彭**(中南大学湘雅医学院)摘要：dsRNA在细胞内诱导同源序列的基因表达受抑的现象称为RNA干扰。其机理的日渐阐明使它有可能在基因敲除，基因功能测定等方面成为一项成熟的技术，这将在生命科学领域中引起深刻变化。本文就dsRNA和RNA干扰的关系，RNA干扰的机制和特点,RNA干扰技术的应用前景等作一综述。关键词：dsRNA;RNA干扰;RNA干扰技术;基因沉寂外源和内源性双链RNA（double-strandedRNAdsRNA）在细胞内诱导同源序列的基因表达受抑的现象称为RNA干扰。早在十年前，科学家们在向牵牛花转导色素合成基

2、因时，观察到“共抑制”（cosupression）,不仅是转入的基因为表达，而且自身的色素合成也减弱了。相似的现象还发生在真菌的研究中，当把合成类胡萝卜素的基因转入到红色面包霉中时，却导致了大约30％转染细胞自身基因的失活，这种现象称为“缓解”（quelling）。但是这种现象一直得不到令人信服的解释。1998年，在研究秀丽隐杆线虫基因沉默机制时发现，将反义RNA、正义RNA和双链RNA分别导入虫体内，作为对照组的正义核酸，虽不能与活性基因或mRNA结合，却同反义核酸有相似的阻断基因表达能力，与反义RNA传统机制相违背、而另人惊奇的是，双链RNA较正义RNA和反义RN

3、A能更高效地阻断相应基因的表达，一直基因表达的效率比单链RNA至少高2个数量级。Fire等称这种现象为RNA干扰现象。RNA干扰现象已证实在一系列的生物中存在，包括植物[1]、真菌[2]、锥虫[3]、囊虫[4]、果蝇[5]和线虫[6]。新近科学家在哺乳动物细胞中也观察到了这一现象[7]。生物界普遍存在的RNA干扰现象给现代生命科学所带来的冲击将是无法估量的，它将不仅能提供一种经济、快捷、高效的抑制基因表达的技术手段，而且有可能在基因功能测定，基因治疗等方面开辟一条新思路。8一、dsRNA的形成由于dsRNA抑制基因表达具有潜在高效性，正常机体任何导致dsRNA形成的情

4、况都会引起不需要的相应基因沉寂。所以正常机体内各种基因有效表达显然需要一套严密防止dsRNA形成的机制。这些机制包括：在进化水平上淘汰那些在两条DNA链上相应位置上都有启动子的基因，否则两条DNA链同时转录出两条互补的RNA就可能形成dsRNA；在正常生理条件下dsRNA的形成必须具有一定的条件如两条互补RNA链相遇，互相识别和一定浓度的RNA连接蛋白存在；在偶然情况下形成的dsRNA还必须具有抵御解链，共价修饰和降解双链RNA等酶作用的能力。此外，细胞对于外来的RNA和自身转录过程中生成的变异RNA（aberrantRNA）所产生的dsRNA引发RNA干扰能力大于拥

5、有自身mRNA序列的dsRNA。与这些设想一致的实验在线虫和锥虫中得到证实[8]。引发RNA干扰的dsRNA产生机制是通过对RNA干扰现象深入研究推断而来的。它包括内源性和外源性两个方面：RNA干扰作为一种防御外来核酸的免疫机制，外来核酸（包括DNA和RNA）的侵入就可能导致dsRNA的产生，如RNA病毒的入侵，DNA病毒在胞内的转录，基因工程中导入转基因，插入逆转的DNA片段等；内源性的dsRNA产生主要是通过RNA依赖的RNA合成酶（RDRP）的作用，它催化合成与机体转录过程中形成的异常RNA互补RNA链而形成dsRNA[9]。8二、dsRNA介导RNA干扰的机制

6、1998年AndrewFire将dsRNA导入线虫内观察到RNA干扰现象后[6]，科学家又在一系列的低等生物中观察到同样的现象，然而将dsRNA（长度＞30bp）导入常用哺乳动物细胞培养株时却不能观察到特异的RNA干扰现象，而是出现诱生干扰素，活化核糖核酸酶L，细胞的基因表达全面受抑和细胞凋亡的现象[5，9]。这不禁使人疑问，哺乳动物中能不能被dsRNA诱导出RNA干扰。但是，实验证明，小鼠的卵母细胞和早期的胚胎中却存在这一现象[10]。随后，Zamore的研究小组发现诱发RNA干扰时dsRNA被切成21-25个碱基的RNA片段[11]，同样，这些小片段的RNA也在果

7、绳细胞外RNA干扰模型中出现[12]。科学家把这种小片段的RNA称为小干扰RNA（smallinterferingRNAsiRNA），并且猜测RNA干扰正是由siRNA诱导。ElbashirSM工作组将体外合成的21nt的siRNA导入哺乳动物细胞培养株中也检测到了特异的RNA干扰现象[7]。如图所示：内源性dsRNA在细胞内ATP和Dicer酶作用下切割为小片段干扰的干扰RNA，siRNA和另外几种蛋白结合形成RNA诱导的沉默复合物（RISC）。RISC结合与siRNA互补的同源基因的mRNA后，mRNA被复合物中具有RNA酶作用蛋白酶降解。从而导