新技术在液基细胞学中的应用及其前景

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1、http://www.chinacytology.com/Show.asp?id=7140&BoardID=52&TB=1新技术在液基细胞学中的应用及其前景（代栏目发刊词）新技术的介入有利于细胞学诊断依据的增加，免疫细胞化学在细胞学上的应用目前开展得还不普及，由于制片的原因，致使多数病例的免疫细胞化学染色失败或对判读无助，因此需要高质量的制片来支持。细胞学标本行电镜检查是一个好方法，也因此解决了关键性的证据问题。可以做更多的新技术、新方法，多方位和多视角解决诊断问题是今后液基细胞学的课题和方向。免疫细胞化学技术近年来，随着在组织学诊断中发挥重要作用的免疫组织化学技术（i

2、mmunohistochemistry，IHC）的广泛应用，在细胞学标本上使用免疫细胞化学（immunocytochemistry，ICC），已被证明对诊断肿瘤是重要的。已引起细胞学家的高度关注。事实上，在手术之前或者因各种原因不宜活检的情况并不罕见，有时候细胞学标本是唯一可以从癌症患者身上取得的标本。由于细胞学检查常被用来区分良性、反应性增生和肿瘤及其癌前状态，因此细胞学者重视以形态学区分良恶性细胞，这也是细胞学的优势所在，加之目前没有标记物可以区分良性细胞和恶性肿瘤细胞的现实，细胞学的免疫细胞化学技术主要解决肿瘤类型问题，而此前在标本问题上的缺陷致使部分肿瘤的类型被

3、诊断错误。在技术层次方面，由于现在的方法已经完善，并且已经可以使用高品质的试剂和实现自动化，技术问题已不再是这一领域的重大关注点。免疫细胞化学（ICC）可以应用于大多数细胞学标本，包括细针穿刺（FNA）、浆膜腔积液、尿液、子宫颈涂片检查，以及灌洗液和刷检标本。上述标本采用液基薄层技术所做的涂片内的细胞相对分散，细胞量丰富，固定及时，单个细胞包括核结构清晰，同一标本可以做3-5张涂片，这些均可以满足免疫细胞化学标记的条件如果细胞数量很多，可以做细胞块切片，就更能够多做切片和选择多项标记了。在液基薄层技术方面，必须选择离心式或有离心步骤的液基制片，因为膜滤法并不适合免疫细胞

4、化学，因为滤膜会吸收免疫试剂和色素原。这将使得背景着色而导致染色不合格。膜滤法在洗涤步骤时也很容易出现从载玻片上脱落的问题。浆膜腔积液应用细胞离心涂片法时，如果蛋白质含量高，可能会导致蛋白质薄膜沉淀覆盖于细胞上，从而阻止试剂充分渗透。在这种情况下，离心前使用等渗盐水简单的洗涤细胞将去除过量的蛋白质。细针吸取的和体腔积液的标本，含血液过多时，可能会对免疫细胞化学造成干扰。这些标本可以保存在Saccomanno溶液中，它不仅可以固定标本，还可以溶解红细胞。免疫细胞化学染色对标本的固定有着严格的标准，固定液包括95%乙醇、95％的异丙醇、或是缓冲福尔马林、甲醛—丙酮，还是用乙

5、醇和福尔马林的混合液固定的细胞学标本，获得的免疫细胞化学结果都一样理想。要注意风干的标本不是适合免疫细胞化学标记的标本。尤其对大多数细胞质和细胞核的标记物来说，这种风干片不能出现最佳标记效果，而且大多数风干标本使用DiffQuick染色法或类似血液染色法。这些染色也干扰需要脱色继续免疫细胞化学标记的程序。长期固定在福尔马林固定液中的标本会逐渐丧失抗原性，而乙醇类固定液则无此现象。免疫细胞化学步骤如下：·.在智能控温电加热器上加热载玻片，移除盖玻片（2秒）并立即浸泡在二甲苯（2分）中。·.下行梯度酒精水化。·.用6％的过氧化氢水溶液阻断内源性过氧化物酶活性（3分钟，室温）

6、。·.将涂片置于抗原修复液(S1699,Dako公司,加利福利亚洲卡宾特利亚)，并在90º的压力锅中加热（10分钟）。·.滴加生物素阻断剂阻断内源性生物素（X0590，Dako公司）。·.一抗孵育（22分钟，室温）。·.滴加结合液：生物素化抗小鼠免疫球蛋白，并孵育（22分钟）（K0690，抗体）。·.添加链菌素-生物素蛋白-过氧化物酶连接液并孵育（22分钟）（K0690，Dako公司）。·.将涂片置于二氨基联苯胺溶液中（10分钟）（K33468，Dako公司）。·.苏木素复染，Harris苏木精复染（15秒）。·.如果是细胞核抗原则替换第10步，改为应用1％硫酸铜（1分

7、钟，室温）作加强指示剂；0.2％碱性孔雀绿（2秒）复染。·.上行梯度酒精脱水，二甲苯透明，并封固。所有洗液和稀释液都是由tris缓冲液配制（抗体，S1968）。步骤5到9可以使用自动化仪器（AutostainerPlus,Dako公司）。微波辐射热诱导抗原修复可能导致免疫细胞化学结果不一致。不锈钢蔬菜蒸笼或压力锅为文火且受热均一，为目前大多数实验室使用。如果修复抗原需要使用蛋白酶消化，则涂片的消化时间应减少至细胞块所用时间的四分之一或五分之一。细胞标本中免疫细胞化学的目标细胞太少且间隔太远的情况并不少见。为了便于快速识别这些细胞，在做免疫