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1、应用背向散射积分技术评价糖尿病大鼠心肌纤维化[摘要]目的检测不同病程糖尿病模型大鼠的心肌背向散射积分(IBS),同时观察纤维化指标,探讨IBS与心肌纤维化的关系。方法腹腔注射链尿佐菌素(65mg•kg-1)建立SD大鼠糖尿病模型,于第4、12、24周测定常规心功能参数(LVEF)、左室后壁校正IBS值(IBS%)、IBS周期性变异幅度(CVIB)。同期检测心肌纤维化指标:心肌羟脯氨酸含量(HPC),Masson染色观察胶原纤维容积分数(CVF)及血管周围胶原面积(PVCA),用免疫组织化学法对心肌胶原蛋白在心肌的分布及表达进行
2、半定量分析,光镜与透射电镜对心肌行组织学观察,并与同龄正常大鼠进行比较。结果(1)与对照组比较,糖尿病组的IB%明显增高(P0.05),第24周时明显降低(P0.05);糖尿病组心肌纤维化指标HPC、CVF、PVCA、胶原蛋白Ⅰ和Ⅲ的表达均明显增高(P0.05).Comparedwiththecontrolgroup,HPC,collagenvolumefraction(CVF),perivascularcollagenarea(PVCA),andtheexpressionofthetypeⅠandⅢcollageninheartwere
3、increasedindiabeticrats(P81材料与方法�1.1糖尿病大鼠模型的制备及分组�8周龄SPF级健康雄性SD大鼠50只(购自北京维通利华实验动物中心),体重180～210g,平均(199.64±11.04)g。抽签法随机选取32只按65mg•kg-1腹腔注射链尿佐菌素(streptozotocin,STZ,Sigma公司)。注射后3d及�7d,断尾法用ACTIVE血糖仪(上海罗氏医药公司)测血糖,将血糖稳定大于16.7mmol•L-1、尿糖持续阳性者定为糖尿病大鼠模型(DM组)。除去未成模4只及死
4、于急性并发症大鼠10只,余下的18只随机分为4、12、24周组,每组6只,同时随机选取同周龄大鼠各6只作为正常对照(CN)组。�1.2超声检测�大鼠腹腔注射10%水合氯醛(350mg•kg-1)麻醉后取左侧卧位,应用HP-SONOS-5500超声诊断仪,S8探头,于M型超声下检测左心室波群并测量大鼠左室舒张内径(Dd)、收缩末期内径(Ds),计算左室射血分数(LVEF)。启动声学密度(AD)定量系统,调节深度(�2～3cm)、总增益、时间补偿增益及侧方增益补偿,获得满意的左室长轴及乳头肌水平左室短轴切面,将连续2.488s内6
5、2帧图像存入磁光盘。感兴趣区(ROI)置于左室后壁中间段的心肌层及心腔内,随心动周期运动。测得以下参数:峰-峰强度(PPI,即背向散射积分周期变化值,CVIB),平均图像强度(AII,即IBS),图像背向散射标准差(SDI)。心肌校正IBS(IBS%)=心肌层IBS值/心腔血流IBS值。�1.3标本采集�腹主动脉放血处死动物,立即取左室心尖部1mm×1mm×2mm左右心肌组织2块,放入2.5%戊二醛中,保存于4℃冰箱,用于电镜观察。将心脏自心尖部至心底部横断为3份,取中间段放入10%中性福尔马林中固定,做好标记,用于组织形态学观察(Mas
6、son三色染色、免疫组织化学染色),另2份放入做好标记的冻存管中,并立即投入液氮中,然后转移至-70℃冰箱,用于心肌羟脯氨酸(HPC)检测。�1.4心肌HPC浓度测定�试剂盒购自南京建成生物技术公司。碱水解法进行前处理,用722可见分光光度计测550nm处各管吸光度值,计算HPC。�1.5Masson三色染色法进行胶原染色�应用Masson三色染色法对心肌进行染色(试剂盒购自福州迈新生物技术公司),胶原纤维呈蓝色,心肌细胞呈红色。用图像采集系统(Olympus公司)采图,Motic8Med数码医学图像分析系统计算心肌胶原容积分数(CVF)
7、和血管周围胶原面积(PVCA)。CVF=胶原面积/总面积,其中胶原面积不包括血管周围胶原面积;PVCA=壁内小动脉管腔周围胶原面积/该小动脉管腔面积。每组取12张切片,每张切片随机取5～�10个200倍显微视野图像。1.6免疫组化染色测定胶原蛋白Ⅰ和Ⅲ的表达�石蜡切片,TGF-β1采用柠檬酸高压抗原修复,胶原蛋白Ⅰ和胶原蛋白Ⅲ采用复合消化液酶修复,分别滴加抗兔胶原蛋白Ⅰ和Ⅲ(武汉博士德生物制品公司)稀释一抗(1∶100),放入4℃冰箱过夜。再滴加生物素化山羊抗兔IgG和试剂SABC,DAB显色。每组取12张切片,每张切片随机取10～15个
8、200倍显微视野图像,测定平均积分光密度(intergratedopticaldensity,IOD)。�1.7透射电镜标本制备�心肌组织脱水,浸透聚合。行超薄切片并用2%醋酸铀及枸橼酸铅染色
