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《微囊藻毒素lr促肝癌过程p53、p16基因mrna表达论文》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
1、微囊藻毒素LR促肝癌过程p53、p16基因mRNA表达论文.freelRNA表达强度,而对p16mRNA表达强度没有影响。结论调节p53表达可能是MCLR促癌过程的重要机制。关键词:藻毒素类;γ谷氨酰转移酶;毒素类;基因,p53;基因,p16;肝肿瘤ABSTRACT:ObjectiveToexplorethemolecularmechanismofmicrocystinLR(MCLR)inducingoflivertumor.MethodsAcordingtediumtermtheorytosetuptheanimalmodel,andbiochemistrytechniquetodetect
2、thecarcinogenesisofthemodel.RTPCRtechniqueandimageanalysisRNAexpressionofthep53andp16inthecourseofinducingtumor.Results(1)MCLRcanenhancethepositivereactionofγGT.(2)MCLRincreasedtheexpressionofp53,andhavenoteffectontheexpressionofp16.Conclusion(1)MCcaninducedlivertumorformationstrongly.(2)Thehighexpr
3、essionofp53mayplayanimportantroleinthecarcinogenesisofMCLRinliver.KEYC)为代表的藻类毒素已被公认为引起肝癌的三大主要环境因素之一1。MC是一种特征性的肝毒素,其中以分布广且肝毒性明显的微囊藻毒素LR(MCLR)为其主要代表物。已有研究表明,福建同安肝癌高发与存在MCLR有关2。许多研究表明，基因表达的改变与肿瘤发生密切相关,为进一步了解MCLR在肝肿瘤发生过程中的作用和机制,笔者选择与调节细胞周期密切相关的p53和p16基因进行研究,通过分析它们在藻类肝毒素促肝癌过程mRNA表达的变化,从而进一步明确MCLR的促癌的机制。1
4、材料和方法1.1材料1.1.1动物CLR纯毒素(美国Sigma公司),20μg/kg腹腔注射。RNA提取用TrizolmRNA提取试剂盒(美国Invitrogen公司),cDNA合成用试剂盒(SuperScriptTMFirstStrandSynthesisSysternforRTPCR,美国Invitrogen公司)。γL谷氨酰α萘胺、双甘氨肽和固浆紫(上海化学试剂公司)。1.1.3藻水在9月份藻类繁殖高峰时用25号浮游生物网采集福建同安汀溪水库的藻细胞,经镜检60%为微囊藻。MC培养基培养,取其培养液作样本,经上海第一医科大学预防医学研究所ELISA法检测,该藻水中含MC529.656ng
5、/L。1.2方法1.2.1二阶段试验大鼠随机分成4组,正常饲养1周后,3组给予DEN200mg/kg腹腔注射1次,1组等容量生理盐水腹腔注射(空白对照组)。第3周末,4组大鼠均行2/3肝切除。第4~10周,DEN+纯毒素组MCLR纯毒素20μg/kg腹腔注射,DEN对照组和DEN+藻水组等容量生理盐水腹腔注射。在此期间,DEN+藻水组饮用藻水,另3组饮用自来水。DEN对照组与DEN+纯毒素组各1只死亡。第10周末处死动物,取肝脏做HE染色、γGT染色和RTPCR。1.2.2γGT染色取γL谷氨酰α萘胺和双甘氨肽各20mg溶解于0.1mol/L(pH7.2)磷酸缓冲液16mL作为甲液;称取固浆紫
6、24mg溶解于生理盐水24mL作为乙液。甲乙两溶液混合过滤制备成染液,将染液倒入染色缸并置于37℃水浴10min,将冷冻肝组织切片与水浴中的染液作用30~60min,取出用蒸馏水清洗,然后在2%CuSO4浸洗2min,蒸馏水再次漂洗。最后苏木精染色,甘油明胶封固。以正常小鼠肾脏作阳性对照,在光镜下观察肝细胞浆,以染成桔红色为阳性。1.2.3反转录聚合酶反应以组织标本100mg∶TrizolTM1mL的比例将肝癌组织溶于TrizolTM中,立即于室温研磨混匀,加入氯仿200μL剧烈震荡15s,室温下静置2~3min,于4℃、7000r/min离心15min。提取上清即为肝癌组织的总RNA,经Su
7、perScriptTrizolTMⅡRT反转录为cDNA。取cDNA2μL于25μL反应体系中进行PCR反应(引物与条件见表1)。每个反应包括不加cDNA模板的阴性对照。PCR反应完成后,取PCR产物5~10μL进行电泳鉴定,于1.5%~2%琼脂糖凝胶,10V/cm凝胶的电压下电泳。凝胶成像系统拍照,ImageProPlus图像分析软件对目的基因及内参物电泳条带进行积分光密度(integralop
