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1、蛋白质组研究中肽质量指纹谱鉴定方法的建立及应用钱小红13王京兰1万晶宏2凌2熊少祥3王光辉3贺福初2罗(1军事医学科学院国家生物医学分析中心,北京100850;2军事医学科学院放射医学研究所,北京100850;3中国科学院化学所国家质谱中心,北京100080)摘要建立了用肽质量指纹谱和数据库检索方法鉴定凝胶电泳分离蛋白质的方法。用标准蛋白质对胶上蛋白质原位酶切制备肽谱的方法进行了讨论。分析了实际细胞蛋白质样品,获得了双向电泳分离的人肺癌细胞蛋白质谱中三个蛋白质点的肽指纹谱,并通过数据库检索分别鉴定为甘油醛232磷酸脱氢酶2、遍在蛋白羧基末端水解同工酶和丙糖磷酸异构酶。关键词蛋白质组;
2、肽质量指纹谱;人肺癌细胞;双向电泳;基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱蛋白质组研究是从整体上观察细胞生长和分化的动态变化,比较在不同环境下细胞或组织蛋白质组的差异,通过观察正常和疾病状态下基因表达产物在数量和结构上的变化,有助于人们对疾病的早期发现,认识疾病的发病机制,设计相关的治疗措确度可达0.1‰～0.01‰,且操作简单,分析速度快,依仪器型号不同一次可分析十几个到几十个样品。二维凝胶电泳分离的细胞或组织蛋白,经胶上原位酶切和质谱分析得到肽质量指纹谱,用数据库检索软件将实验所得肽质量数与数据库中每种蛋白质的酶解理论肽质量数相比较来鉴定蛋白质。我们施1～5。目前蛋白质组研究的主要技
3、术手段是二维凝胶电泳、计算机图像分析和蛋白鉴定技术。蛋白鉴定方法有氨基酸序列分析、组成分析、肽质量指纹谱和肽序列标签分析等6～8。其中肽质量指纹谱(pep2tidemassfingerprinting,PMF)方法鉴定蛋白质是目前蛋白质组研究较为常用的鉴定方法。由于各种蛋白质的氨基酸序列(一级结构)不同,蛋白质被酶解后产生的肽段序列也各异,肽混合物质量数亦具特征性,称为肽质量指纹谱(PMF),可用于蛋白质的鉴定9。基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(matrixassistedlaserdesorption/ionizationtimeofflightmassspectrometry
4、,MALDI2TOF2MS)是最有效的分析肽混合物的质谱仪,肽混合物不需分离可直接分析,基质辅助激光电离方法能耐受一定浓度的盐,仪器灵敏度高,标准样品1pmol的量就足够,质量数准曾用标准蛋白质对这一方法进行过初步的探索10。用PMF鉴定蛋白质消耗少,效率高,肽谱制备阶段可同时处理多个样品,适合大规模,高通量的蛋白质鉴定工作。研究肿瘤细胞蛋白质组,有助于肿瘤的早期发现,研究肿瘤的致病机制,开发新的治疗措施及药物。本文报道用标准蛋白质建立了肽质量指纹谱鉴定技术,并应用于鉴定二维凝胶电泳分离的人肺巨细胞癌细胞蛋白质。材料和方法(MaterialsandMethods)11.1材料人肺巨细
5、胞癌PLA2801细胞株由军事医学科学院基础医学研究所陆应麟教授惠赠。30%丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺(29∶1,3.3%C)溶液、三羟甲基氨基甲烷购自Bio2Rad公司;IPG胶条购自AmershamPharmacia公司;三氟乙酸(TFA)购自Fluka公司,乙腈(ACN)购自Fisher公司;胰蛋白酶(trypsin,modified、sequencinggrade)购自Boehringer公司;α2氰基242羟基肉桂酸、胰岛收稿日期:1999211215接受日期:2000202214国家自然科学基金重大项目资助课题No.39990600;军事医学科学院科技创新启动基金资助课题(
6、1998～1999)3联系人:Tel,010266930306;Fax,010268186281;e2mail,qianxh@nic.bmi.ac.cn素、胰岛素氧化B链购自Sigma公司。固相pH梯度等电聚焦仪IPGphorIEFSystem为AmershamPharmacia公司产品;垂直板电泳仪PROTENIIxiCell及附件、PDQUEST6.0二维电泳图像分析软件为Bio2Rad公司产品。TofSpecMALDI2TOF2MS为Micromass公司产品;BIFLEXIIIMALDI2TOF2MS为Bruker公司产品,具反射(reflector)和延迟提取(delaye
7、dextrac2tion)功能。1.2方法1.2.1细胞蛋白质的提取和二维凝胶电泳分离人肺癌细胞株PLA2801细胞培养于含10%小牛血清培养基,收集细胞加裂解液快速冻融3～4循环,离心收集上清。用IPGphorIEFSystem进行第一向等电聚焦电泳,蛋白质上样量250μg。等电聚焦程序:12h重泡涨,其间加低电压(<50V)帮助样品进入IPG胶条;200V,1h;500V,1h;500～1000V线性上升1h;8000V,8h。聚焦完毕的IPG胶条在平
