利用同尾酶技术构建pet15b论文

《利用同尾酶技术构建pet15b论文》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、利用同尾酶技术构建pET15b论文姚玲玲，王家宁，黄永章，郭凌郧摘要目的:利用同尾酶技术构建pET15b-PEP-1-CAT重组质粒，为制备PEP-1-CAT融合蛋白进而为防治心肌缺血再灌注损伤奠定基础。方法:设计并合成两端分别带SalⅠ和BglⅡ酶切位点的CAT引物，用PCR方法以pZeoSV2(+)-CAT质粒为模板，特异性扩增CAT全长cDNA。将扩增的CATcDNA与dATP反应,利用TaqDNA聚合酶具有的非模板依赖性末端转移酶活性在CATcDNA的3′末端加"A"并纯化，然后应用TA克隆策略将纯化后的CATcDNA插入至中

2、间载体pGEM-TEasyVector中.freelHⅠ双酶切，利用同尾酶（SalⅠ与XhoⅠ，BglⅡ与BamHⅠ）能酶切产生相同黏性末端的特性，将回收得到的CATcDNA片段与pET15b-PEP-1相连，构建出重组质粒pET15b-PEP-1-CAT，经PCR及酶切鉴定，并通过核苷酸序列测序证实。结果:获得pET15b-PEP-1-CAT重组子，经测序分析证实，克隆入pET15b的PEP-1序列与设计合成的PEP-1序列一致，CAT序列与GeneBank中登录号为“AY028632”的CATcDNA序列一致。结论:pET15b-

3、PEP-1-CAT的成功构建为产生融合蛋白Histag-PEP-1-CAT进而为防治心肌缺血再灌注损伤奠定了基础。关键词同尾酶;过氧化氢酶;TA克隆;DNA重组;PEP-1肽Abstract:ObjectiveToconstructtherebinantplasmidpET15b-PEP-1-CATertechniqueandprovideavectorexpressingPEP-1-CATfusionproteinforthepreventionandtherapyofmyocardialischemia-reprefusionin

4、jury.MethodUsingpfuDNApolymerase,thefull-lengthhumancatalasecDNAplifiedviaPCRfrompZeoSV2(+)-CATplasmid.ThePCRproductplate-independentterminaltransferaseactivityofTaqDNApolymerase.ThepurifiedproductsofCATcDNAedintoDH5α.ThecorrectrebinantedafterpGEM-T-CAT.Tidedigestedandn

5、amedafterpET15b-PEP-1.pET15b-PEP-1andpGEM-T-CATHIandSalI-BglⅡ,respectively.ThepurifiedlinearfragmentofpET15b-PEP-1andthepurifiedCATcDNAfragmentersididedthatthePEP-1andthehumanCATcDNAsequenceofpET15b-PEP-1-CATbysequencingancatalasecDNAsequenceofGeneBank"AY028632",respect

6、ively.ThepET15b-PEP-1-CATofprokaryoticexpressionplasmididprovidesabasisforproductionofHistag-PEP-1-CATfusionproteintopreventandtreatmyocardialischemiareperfusioninjury.Keyarker）为北京华美生物工程有限公司产品。PCR引物及PEP-1的寡核苷酸链由赛百盛公司合成。1．1．3质粒与菌株:模板质粒pZeoSV2(+)-CAT由美国西奈山医学院生化/药理学系白景香博士惠

7、赠；质粒pET15b购自Novagen公司；pGEM-TEasy载体系统为Promega公司产品；大肠杆菌DH5α为本室保存。1．2方法1．2．1pET15b-PEP-1-CAT构建流程图（图1）1．2．2PCR扩增目的片段:根据GeneBank中登录号为“AY028632”的人CATcDNA设计合成CAT的引物，两端分别直接引入SalⅠ、BglⅡ酶切位点：上游引物：5′SalⅠGTCGACATGGCTGACAGCCGGGATCCCGCC3′（30bp）,.freelol/L）、上下游引物各10μl、Pfu酶4μl、模板2μl，补加去

8、离子水至总体积100μl。循环参数：94℃预变性5min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸2min，30个循环后72℃延伸10min。取10μlPCR产物行1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果得到一条约1600