定向基因传递载体pet15bzvp1的构建

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1、定向基因传递载体pET15bZVP1的构建【摘要】目的在JCVVP1氨基末端插入SPA的IgG结合区(Z区)，构建原核表达质粒pET15bZVP1。方法PCR扩增JCV基因组VP1和SPA基因的Z片段;重组PCR连接Z片段和VP1;BamHⅠ和NcoⅠ双酶切将ZVP1片段插入原核表达质粒pET15b。结果经PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳纯化，分别得到VP1和Z片段;再用重组PCR将Z片段和VP1连接成ZVP1重组基因;双酶切将ZVP1插入pET15b的BamHⅠ和NcoⅠ两个酶切位点之间，并经酶切鉴定和DNA测序证实。Westernblott

2、ing证明pET15bZVP1在体外表达重组蛋白VP1Z。结论成功在VP1氨基末端插入Z区，构建了原核表达质粒pET15bZVP1，并体外表达重组蛋白VP1Z。【关键词】基因治疗;定向基因传递;JC病毒)ABSTRACT:ObjectiveToconstructthevectorpET15bZVP1byinsertingtheZfragmentintoaminoterminalofJCVVP1.MethodsTheVP1andZfragmentwereamplifiedbyPCRfromplasmidpET15bandpEZZ18re

3、spectively,andthentheywerelinkedbyrecombinantPCR.TheZVP1fragmentwasinsertedintoplasmidpET15bbyrestrictionenzymeBamHⅠandNcoⅠ.ResultsTheVP1andZfragmentwereobtainedbyPCRandgelpurification.TheZVP1fragment,whichwaslinkedbyrecombinantPCRfromVP113andZfragment,wasinsertedintoplasmidpE

4、T15bbetweenBamHⅠandNcoⅠsites,andconfirmedbyenzymedigestionandDNAsequencing.TheexpressionofVP1ZwasconfirmedbyWesternblotting.ConclusionTheplasmidpET15bZVP1hasbeenconstructedsuccessfullybyinsertingZfragmentintoaminoterminalofVP1.　　KEYWORDS:genetherapy;targetedgenedelivery;JCvi

5、rus　随着人口老龄化的迅速发展，许多中枢神经系统疾病将会严重威胁人们的健康。对于这些疾病至今仍缺少有效的治疗方法，基因治疗被认为是最有希望的方法之一，而制约基因治疗的核心是缺少理想的基因载体[1]。JC病毒(JCV)是一种嗜神经病毒，其主要外壳蛋白VP1在体外可自我组装成病毒样颗粒(VLP)[2]。研究证明[3]VLP具有与完整病毒相同的受体结合、胞吞转运等生物活性。在体外，VLP可经二硫苏糖醇(DTT)和EGTA裂解为VP1单体;含钙离子溶液透析时，VP1又可重新组装成VLP，并包裹外源性DNA[4]。因此，VLP具有基因载体的基本特性。13　　由

6、于JCV受体广泛分布于多种组织来源的细胞表面[5]，因此，VLP作为基因载体缺乏组织细胞特异性。如能使其具有靶向性，特异性结合到靶细胞，则VLP有望成为一个理想的中枢神经系统基因载体。研究表明[67]，从金黄色葡萄球菌细胞膜提纯的蛋白质A(SPA)，能与IgG抗体Fc端结合，将SPA的IgG结合区(Z区)插入某一蛋白质，该蛋白质即具有IgG结合功能。体外限制性蛋白水解分析发现，JCVVP1氨基末端暴露于VLP表面，对VLP颗粒形状维持并非必需，体外修饰并不影响VLP的生物特性[4]。如果将SPA的Z区插入VP1氨基末端，体外重组病毒样颗粒(VLP

7、Z)，不仅保持VLP原有的生物特性，同时也具有IgG结合功能。借助特异性抗体，VLPZ可特异性结合到靶细胞，实现治疗基因的定向传递。为此，本研究在JCVVP1氨基末端插入SPAZ区，构建原核表达质粒pET15bZVP1。　　1材料与方法　　1.1材料质粒pET15bVP1由北海道大学医学部分子细胞病理研究室澤洋文教授惠赠，VP1片段全长1065bp。质粒pEZZ18购自PharmaciaBiotech公司，包含两个重复的Z片段，每个Z片段全长174bp。质粒pET15b购自Novagen公司，为含T7启动子的表达质粒，氨苄青霉素抗性，全长570

8、8bp。　　1.2方法　　1.2.1扩增VP1片段上游引物VP15′13GCTCAGGCGC