snt 2850-2011 病毒性出血性败血症检疫技术规范

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1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２８５０—２０１１病毒性出血性败血症检疫技术规范犙狌犪狉犪狀狋犻狀犲狆狉狅狋狅犮狅犾犳狅狉狏犻狉犪犾犺犪犲犿狅狉狉犺犪犵犻犮狊犲狆狋犻犮犪犲犿犻犪（犞犎犛）２０１１０２２５发布２０１１０７０１实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局犛犖／犜２８５０—２０１１前言本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准参考了世界动物卫生组织（ＯＩＥ）《水生动物病诊断手册２００９版》第２．３．９章中病毒性出血性败血症的方法。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共

2、和国深圳出入境检验检疫局、中华人民共和国北京出入境检验检疫局、中华人民共和国江苏出入境检验检疫局。本标准主要起草人：高隆英、张利峰、段宏安、史秀杰、徐晔、江育林。Ⅰ犛犖／犜２８５０—２０１１病毒性出血性败血症检疫技术规范１范围本标准规定了病毒性出血性败血症病毒（ｖｉｒａｌｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉｃｓｅｐｔｉｃａｅｍｉａｖｉｒｕｓ，ＶＨＳＶ）的检测，经细胞分离到病毒后，用间接荧光抗体试验（ＩＦＡＴ）、酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）、逆转录聚合酶链式反应（ＲＴＰＣＲ）及测序等鉴定的检疫规范。本标准适用于鱼类病毒性出血性败血症的检疫诊断和流行病学调查。２

3、规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ／Ｔ６６８２分析实验室用水规格和试验方法ＧＢ／Ｔ１８０８８出入境动物检疫采样３缩略语下列缩略语适用于本文件。ＢＦ２：蓝鳃太阳鱼细胞系ＣＰＥ（ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃｅｆｆｅｃｔ）：细胞病变效应ＤＥＰＣ：焦碳酸二乙酯ｄＮＴＰ（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）：脱氧核糖核苷三磷酸ＥＤＴＡ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃａｃｉｄ）：

4、乙二胺四乙酸ＥＰＣ：鲤鱼上皮瘤细胞系ＦＣＳ（ｆｅｔａｌｃａｌｆｓｅｒｕｍ）：胎牛血清ＨＥＰＥＳ：犖２羟乙基哌嗪犖’２乙磺酸ＲＴＧ２：虹鳟鱼性腺细胞系ＲＴＰＣＲ（ｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ）：逆转录聚合酶链式反应犜犪狇酶（犜犪狇ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）：犜犪狇ＤＮＡ聚合酶Ｔｒｉｓ［ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ］：三（羟甲基）氨基甲烷ＶＨＳＶ（ＶｉｒａｌＨａｅｍｏｒｒｈａｇｉｃＳｅｐｔｉｃａｅｍｉａｖｉｒｕｓ）：病毒性出血性败血症病毒４仪器

5、和设备４．１超净工作台。４．２生化培养箱。４．３荧光倒置显微镜。４．４冷冻离心机。４．５－８０℃超低温冰箱。１犛犖／犜２８５０—２０１１４．６－２０℃普通冰箱。４．７磁力搅拌器。４．８真空高压过滤器。４．９ＰＣＲ仪。４．１０微量移液器及吸头。４．１１电泳仪。４．１２凝胶成像仪或紫外透射仪。４．１３酶标仪。４．１４剪刀、镊子、离心管、ＰＣＲ管和细胞培养器皿等耗材。５试剂和材料５．１水：应符合ＧＢ／Ｔ６６８２中一级水的规格，用于ＲＴＰＣＲ时要用ＤＥＰＣ处理，除去ＲＮＡ酶。５．２ＶＨＳＶ参考株：由国家质量监督检验检疫总局指定提供。５．３抗ＶＨＳＶ的Ｉｇ

6、（包被用）：由国家质量监督检验检疫总局指定单位提供。５．４抗ＶＨＳＶ的抗血清和包被用Ｉｇ不是来源于同一种动物：由国家质量监督检验检疫总局指定单位提供。５．５ＦＩＴＣ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）：标记的抗抗体：是抗５．４中所指动物的抗体。５．６辣根过氧化物酶标记的抗抗体：是抗５．４中所指动物抗体。５．７细胞生长液：含１０％胎牛血清的１９９细胞培养液（含Ｅａｒｌｅ’ｓ平衡盐的１９９培养基配制）（配制见附录Ａ）。５．８细胞维持液：含２％胎牛血清的１９９细胞培养液（含Ｅａｒｌｅ’ｓ平衡盐的１９９培养基配制）。５．９无水乙醇，分析纯

7、，使用前预冷到－２０℃。５．１０反转录酶ＡＭＶ：－２０℃保存，避免温度剧烈变化。５．１１ＲＮＡ酶抑制剂：－２０℃保存，避免温度剧烈变化。５．１２犜犪狇酶：－２０℃保存，避免温度剧烈变化。５．１３ＤＮＡＭａｒｋｅｒ２０００。５．１４琼脂糖。５．１５引物：正向引物Ｆ：５’ＡＴＧＧＡＡＧＧＡＧＧＡＡＴＴＣＧＴＧＡＡＧＣＧ３’反向引物Ｒ：５’ＧＣＧＧＴＧＡＡＧＴＧＣＴＧＣＡＧＴＴＣＣＣ３’该引物可以扩增ＶＨＳ病毒目前已知的４个基因型所有毒株的Ｎ基因的５０５个碱基片段（序列参见附录Ｂ）。５．１６丙酮：分析纯。５．１７０．

8、０５％吐温８０。５．１８ｐＨ８．５甘油生理盐水。５．１９５％脱脂奶。６采样对有临床症状的鱼（参见附录Ｃ），如果是体长＜４