氧化苦参碱对家兔激素性股骨头坏死的影响

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1、氧化苦参碱对家兔激素性股骨头坏死的影响：赵薇，丁娟，芦晓红，李燕，李建宁【摘要】目的观察氧化苦参碱对家兔激素性股骨头缺血坏死的保护作用。方法50只青紫兰家兔随机分为5组：空白对照组、模型对照组(醋酸泼尼松龙)、氧化苦参碱10、20、30mg·kg-1三个剂量组，经不同剂量氧化苦参碱预处理后给予大剂量糖皮质激素诱导发生股骨头坏死。通过股骨头的病理改变来评价氧化苦参碱对激素性股骨头坏死的保护作用。通过RT-PCR和T)主要用于慢性乙型肝炎的辅助治疗[2]。近期研究显示OMT具有舒张血管和保护血管内皮的作用[3]，而股骨头坏死正是由于血管生成障碍、血供不足所

2、致。所以理论上OMT具有潜在的加强血供的作用，但其对股骨头缺血坏死是否有保护作用尚无报道。由于血管内皮生长因子(VascularendothelialgroL-1，批号：20070402)。　　1.1.2实验动物青紫兰家兔2.0～2.5kg，雌雄不拘，由宁夏医科大学实验动物中心提供。　　1.1.3试剂Trizol试剂盒和RT-PCR试剂盒购自上海雷浩信息科技有限公司，VEGF165鼠单克隆抗体和HRP-羊抗鼠IgG抗体购自北京中山生物技术公司。　　1.2实验方法将青紫兰家兔随机分为5组，每组10只，分别为空白对照组、模型对照组、OMT组。OMT组家兔分

3、别耳静脉注射10、20、30mg·kg-1OMT，空白组和模型组给予NS，容量均为5mL·kg-1。10min后臀肌注射醋酸泼尼松龙10mg·kg-1，空白对照组给予NS0.2mL·kg-1。3d后再次ivOMT。7周后采用空气栓塞法处死家兔，迅速取出一侧股骨头用DEPC水冲净后置于液氮中保存，用于组织总蛋白的提取。将其中300mg骨组织，放入提前预冷的研钵中研碎，用于总RNA提取。　　1.3组织病理学观察10%甲醛固定一侧股骨头组织，24h后脱钙4d，常规脱水石蜡包埋行5μm连续切片，HE染色，光镜下观察骨组织形态变化。　　1.4RT-PCR检测家兔

4、股骨头组织中VEGF的mRNA水平　　1.4.1组织总RNA提取采用Trizol一步法提取组织总RNA，取2μL行1%琼脂糖凝胶电泳。　　1.4.2VEGF引物设计利用GENEBANK获得兔VEGF165基因序列，选择其抗原性最强的部分设计兔VEGF165的基因片段(190bp)引物。Sense：5'GTGGACATCTTCCAGGAGTACC-3'，Anti-sense：5'CTTTGGTCTGCATTCACA3'。兔β-actin片段(409bp)引物序列如下：Sense:5'-TCTTCCAGCCCTTCCTG-3'，Anti-sense:5'-

5、CGTTTCTGCGCCGTTAGGT-3'。　　1.4.3RT-PCR取模板mRNA10μg按试剂盒说明合成cDNA。然后取cDNA2μL、2×TaqPCRMix10μL、10pM的VEGF上下游引物各1μL和ddH2O6μL至总体积20μL。按照下述条件行PCR反应:95℃变性4min，55℃退火30s，72℃延伸35s，共进行30个循环。最后一个循环结束72℃保温15min。取10μLPCR产物行2.0%琼脂糖凝胶电泳。凝胶分析成像后行灰度扫描分析。　　1.5oticImagesAdvanced3.1图像处理系统采集图像。　　1.6统计学方法采用

6、SPSS统计软件，应用图像分析软件分析目的条带的相对灰度值，并计算各组别/模型对照组的比值，计量资料以均数±标准差(±s)表示，组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。　　2结果　　2.1病理组织切片结果空白对照组可见骨小梁结构完整，排列规则，期间均匀分布有大量成骨细胞，无空骨陷窝，骨髓腔中含有大量的造血细胞，偶见极少量脂肪细胞;模型对照组中骨组织结构紊乱，骨小梁萎缩变窄，排列不规则，可见大量充满脂肪细胞的空骨陷窝，骨细胞核固缩，甚至消失，髓腔内造血组织明显减少，与空白对照组相比，成骨细胞数目减少，部分微血管内出现脂滴;中、高

7、剂量氧化苦参碱组中骨小梁略稀疏，偶见个别骨组织碎片，骨髓腔内造血组织变化不大，期间可见少量小脂滴(图1，见封4)。　　2.2RT-PCR结果　　在大约190bp处可见目的条带-兔VEGF165的基因片段。与空白对照组相比，模型对照组兔股骨头组织中VEGF165mRNA的表达量极低。而OMT中、高剂量VEGF165mRNA的表达明显上调，P<0.05(图2)。　　2.3WesternBlot结果各组在相对分子质量为23kD处可见有VEGF165条带出现。模型对照组中VEGF的表达水平极低;氧化苦参碱中、高剂量组中VEGF的表达明显高于模型对照组，P

8、<0.05(图3)。　　本研究采用大剂量糖皮质激素家兔臀肌注射的方法建立股骨头缺血坏死的