猪传染性胸膜肺炎的小鼠动物模型构建

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1、猪传染性胸膜肺炎的小鼠动物模型构建猪传染性胸膜肺炎（porcinecontagiouspleurop-neumonia,PCP）是一种由胸膜肺炎放线杆菌（Acti-nobacilluspleuropneumoniae,APP））引起的高度接触性呼吸道疾病，又称猪接触性传染性胸膜肺炎。自1957年，Pattison首次报道以来，世界各地相继报道了本病，猪传染性胸膜肺炎己经成为威胁养殖业健康发展的严重疾病，广泛分布于世界各地[1].近年来猪传染性胸膜肺炎发病和流行呈逐年上升的趋势，猪感染本病后常出现急性和慢性感染，急性猪传染性胸膜肺炎以急性出血性胸膜肺炎为特征，病猪发热（可达42℃）、呼吸困

2、难、食欲不振，呈现高死亡率；慢性感染后以纤维素性坏死性胸膜肺炎为特征，潜伏于猪群内，可使患病猪生长缓慢，饲养报酬降低。常与猪瘟、蓝耳病及链球菌等其他疾病混合感染[2],导致猪群的高发病率和高死亡率，危害极其严重，使控制难度加大，已被国际公认为现代养猪业的重要疫病之一。自1987年我国黑龙江地区首次报道以来[3],山东、河南、北京等地区均相继报导该病发生，且血清型之间存在差异，目前仍在部分地区流行和蔓延，对我国养殖业发展造成重大的损失。猪胸膜肺炎放线杆菌（APP）属于放线菌属，革兰氏染色阴性，两极着色，有荚膜，无芽孢，无运动性。主要包括生物Ⅰ型（NAD依赖型）毒力较强，生物Ⅱ型（非NAD依

3、赖型），毒力较弱。根据细菌荚膜多糖和脂多糖的不同，生物Ⅰ型分为12个血清型，生物Ⅱ型有2个血清型（13、14），其中血清5型进一步分为5A和5B两个亚型。我国流行的主要以生物Ⅰ型中的血清7型为主，其次为血清1、2、4、5、10型，其余血清型主要分布于欧洲等地区[4].由于APP的血清型众多，且各个血清型间的交叉保护性不强，给生产过程中的预防工作带来极大的困难；免疫接种是预防本病的主要途径，但由于其免疫机制尚不明确，至今国内外仍缺乏理想的疫苗。因此，实验采用人工感染各种常用实验动物的方法，模拟病原菌的感染条件[5],建立本病的小鼠动物模型，为今后的疫苗研发和揭示该病的发病机制奠定基础。1材

4、料与方法1.1实验材料1.1.1菌株和实验动物猪传染性胸膜肺炎放线杆菌7型菌株，为从大庆市周边猪场中发病猪体内分离得到，并通过细菌生化试验和血清学试验鉴定为猪胸膜肺炎放线杆菌7型，保存于黑龙江八一农垦大学预防兽医学实验室，猪胸膜肺炎标准阳性血清由哈尔滨兽医研究所惠赠；实验用5周龄SPF级昆明小鼠（KM小鼠），体重20~28g,购于北京维通利华实验动物有限公司；SPF级大鼠，体重280g左右，清洁级豚鼠，体重250g左右，清洁级兔子，体重1.3kg左右，购于哈尔滨医科大学实验动物中心。1.1.2主要试剂胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）液体培养基，胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）固体培养基购自青岛高科园

5、海博生物技术有限公司；NAD生长因子购自amresco公司；2000bpmaker购自takara公司；琼脂糖购自Bioiddot;min-1摇床培养12h,用无菌PBS将培养物配制成1.8107CFU、3.6107CFU、7.2107CFU和1.44108CFU等不同剂量，参照王姝优等报道的方法[7],通过腹腔注射感染不同品种的各组模型动物，实验组每组8只，对照组4只，对照组腹腔注射等量的无菌生理盐水；观察各组动物的临床症状和死亡规律，筛选出最易感的模型动物。1.2.2最佳感染途径的筛选根据上步筛选出的最佳感染动物小鼠，以1.8107、3.6107、7.2107和1.44108CFU四

6、种不同剂量的菌液，通过滴鼻、皮下注射、肌肉注射、腹腔注射等不同方式进行感染实验，每组均设置对照组，对照组注射等量的生理盐水，观察各组小鼠的临床表现和死亡情况，探索不同的接种方式对小鼠感染情况的差异，从而确定最适合的感染途径[8].1.2.3半数致死量的测定根据之前得出小鼠全部死亡的剂量数据，用无菌PBS缓冲液，将App-7原菌液分别稀释到1.15108,9.21107,7.37107,5.9107,4.72107,3.77107,3.02107,2.41107和1.93107CFU等不同剂量接种小鼠，将小鼠随机分为10组，其中1~9组为实验组，每组12只，通过腹腔注射的方式注射上述不同剂

7、量的菌液；第10组为对照组，6只，注射等量的生理盐水。筛选出App-7对小鼠的最小致死量（Dn）和最大致死量（Dm），并根据改进的寇氏法则[9],计算出App-7对小鼠的半数致死量（LD50）。1.2.4临床剖检和细菌学检查通过2倍半数致死量的菌液对10只KM小鼠进行感染实验，对照组4只，注射等量的无菌生理盐水；定时观察，并记录感染后4d内各组小鼠的临床症状和死亡情况，并对死亡小鼠进行剖检，观察其病理变化，同时解剖对照组小鼠，与感染