白骨壤重金属耐受性相关基因amnramp3的克隆与分析

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1、doi:10.6043/j.issn.0438-0479.201611033白骨壤重金属耐受性相关基因AmNramp3的克隆与分析张骥诚1，梁嘉庆2，俞锦锋1，刘景春1，卢豪良1，严重玲1*（1.厦门大学环境与生态学院，福建厦门361102；2.四川农业大学生命科学学院，四川雅安625014）摘要：白骨壤Avicenniamarina(Forsk.)作为红树林的先锋植物，广泛分布于我国南海沿岸，是一种研究红树植物重金属污染物耐受性背后分子机制很好的材料。以抑制消减杂交获得的白骨壤重金属耐受性相关基因A

2、mNramp3片段为基础，设计基因特异性引物，利用cDNA末端快速扩增（RACE）技术克隆了其全长，长度为1958bp；通过荧光定量PCR检测了其在重金属胁迫时白骨壤叶、茎和根中的表达情况，其在叶中的表达量高于根和茎，该基因的表达量在镉胁迫下根和茎中有快速的响应。利用生物信息学方法预测并分析了该基因的开放阅读框，位置位于1~1527bp，编码508个氨基酸；并预测分析了该基因的蛋白构象图。该蛋白结构不含有信号肽，说明其不是分泌蛋白；其具有很复杂的跨膜结构，说明它是一种跨膜蛋白。所以，AmNramp3基

3、因编码一种跨膜蛋白，与重金属镉的跨膜运输功能密切相关。这些技术手段为后续分析该基因发挥功效的可能分子机制奠定了基础。关键词：白骨壤；抑制消减杂交；重金属耐受性；镉；Nramp中图分类号：Q94文献标志码：A红树林由各种类型中等高度的树木和灌木组成，通常位于热带、亚热带和温带沿海系统[1]，红树林生态系统的海岸湿地是迁徙鸟类、动物和浅海底河口甲壳类动物重要栖息地[2,3]。因为红树林沉积物中有机物含量高、pH值低，并且有较多的细颗粒，所以很容易积累重金属[4]。镉在于自然环境中是一种高活性和持久的重金属

4、，即使在非常低的浓度，它仍然对植物有着很强的毒性[5,6]。尽管红树林生态系统收到河流和污水的排放，它们仍对重金属污染物表现出很强的耐受性[7,8]。白骨壤Avicenniamarina(Forsk.)作为红树林的先锋植物[9]，广泛分布于我国南海沿岸。白骨壤相比其他红树林物种表现出更强的重金属耐受性[10]。重金属污染物的胁迫会导致白骨壤产生一系列复杂的生理响应反应，但是对其分子机制了解并不多。因此，需要更详细的分子生物学研究以阐明白骨壤重金属污染物的耐受性机制。本研究依据前期工作基础（文章暂未发表

5、），以抑制消减杂交技术[11]筛选出若干白骨壤重金属污染物耐受性相关基因，发现一个与重金属转运功能有重要联系的基因，其与GenBank中可可(Theobromacacao)的Nramp3蛋白同源性高达99%，课题组将其命名为AmNramp3。Nramp基因家族首先在动物中发现的，此基因家族与动物病原菌入侵所产生的抗性相关[12]，后来此基因在植物中也被克隆，随着研究的深入，发现该基因在植物中与金属离子的转运起着至关重要的作用。Nramp基因家族分别在水稻[13]、拟南芥[14]、柑橘[15]等植物中详

6、细研究了其功能，发现Nramp基因家族在金属离子Fe、Mn、Cd、Cu、Co、Zn、Ni的转运中都起着重要作用[16]。但是在红树植物中，Nramp基因家族的研究还非常少，所以本研究利用cDNA末端快速扩增（RACE）技术克隆了其全长，通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测了其在重金属胁迫时白骨壤叶、茎和根中的表达情况，利用生物信息学方法预测并分析了该基因的开放阅读框、氨基酸的一级结构、蛋白质的二级结构、信号肽位点、跨膜结构、蛋白质疏水性以及亚细胞定位，为后续分析该基因发挥功效的可能分子机制奠定

7、了基础。1材料与方法1.1材料白骨壤的种苗采自福建省云霄县漳江口国家级红树林自然保护区(23°55'N,117°26'E)的白骨壤林。挑选外观饱满且无明显病虫害的种苗进行栽培。种苗经过0.1%高锰酸钾溶液浸泡半小时后用清水洗净栽培于洁净海沙中。添加NaCl质量分数为1%的Hoagland营养液(7.0mmol/LKNO3,2.0mmol/LKH2PO4,2.0mmol/LMgSO4,46µmol/LH3BO3,0.32MCuSO4,0.76µmol/LZnSO4,9.2µmol/LMnSO4,0.5µ

8、mol/L(NH4)6Mo7O2,20µmol/LFe-EDTA,20mmol/LFeSO4,5.0mmol/LCa(NO3)2,pH6.0)[17]培养，每周更换营养液，培养9个月用于后续实验。1.2试剂SMARTerRACEcDNAAmplificationKit与Advantage2PolymeraseMix购自Clontech公司，PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser购自TaKaRa公司，FastStartU