光皮桦blknox家族基因表达及互作机制分析

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1、光皮桦BlKNOX家族基因表达及互作机制分析第一章文献综述1.1酵母双杂交系统的研究进展随着分子生物学技术的发展，研究重点从结构基因过渡到基因所编码的蛋白质。蛋白质是生物体中生命活动的主要体现者，生物体中的绝大多数生命活动都是在各种蛋白质的参与下完成的。蛋白复合体或蛋白质间的相互作用在有机体细胞的生命活动中如细胞分裂、信号转导、抗原识别、蛋白质的运输、遗传信息的表达和调控等方面起重要的作用。目前用于研究蛋白质的方法主要有酵母双杂交、GSTpull-doactivatingsequence,UAS)结合的DNA结合结构域(bindingdomain,BD)；另一

2、个是位于C端768-881位氨基酸残基区段转录激活结构域(activationdomain,AD)组成。这两个结构域对于基因的转录活化都是必须的，单独的BD虽然可以和UAS结合但并不引起转录，单独的AD不能与UAS结合，只有当BD与AD分别表达形成的融合蛋白发生相互作用，GAL4转录因子才具有转录活性启动子下游基因的转录[10-12]。在GAL4系统中，报告基因有ADE2、HIS3、LacZ和MEL1，通过营养缺陷筛选以及蓝白斑结果灵敏地来筛选或验证两个蛋白之间是否存在相互作用[13]。.1.2KNOX相关基因的研究进展在生物的发育过程中同源异型盒基因编码的蛋

3、白作为转录因子起重要的调节作用。从酵母、真菌到动植物，大量的同源异型盒基被分离出来，研究发现，同源异型盒蛋白在生物的形态建成中发挥着重要作用。KNOX家族属于TALE(threeamino-acidloopextension)同源异型盒蛋白超家族，其编码的蛋白质是非典型的同源异型盒蛋白包括四个区域MEINOX域、GSE域、ELK域、HD域。其中MEINOX域包括KNOXA域和KNOXB域是位于KNOX蛋白的N端的约100个氨基酸长度的保守区域，KNOXA域在KNOX基因异源表达产生表型变化的过程中起重要作用，同时可能对目的基因的转录起抑制作用，KNOXB域对于

4、二聚体的形成和转基因植株异常表型的产生有重要作用。GSE域位于MEINOX域和ELK域之间，较小且保守程度不高，参与调控蛋白的稳定性[19]。ELK域编码核定位信号，参与蛋白质之间的相互作用。HD域位于KNOX蛋白的C端是典型的同源异型盒区，参与DNA的结合和同源二聚体的形成，包括63个氨基酸，在第1个螺旋与第2个螺旋之间存在3个额外的氨基酸(P-Y-P)[20-21]。KNOX基因分布广泛，几乎存在于所有的单子叶和双子叶植物中。基于序列的同源性，研究者将KNOX基因分为KNOXI和KNOXII两类。其中KNOXI在分生组织中表达，是分生组织发生与维持所必需的

5、关键基因，通过调控与器官发生相关的细胞分化，最终影响侧生器官的形态建成；KNOXII的表达模式多样化，几乎在所有的组织中都有表达，研究表明KNOXII基因参与调控植物细胞壁的次生生长、同时在根和茎、种皮、心材等的发育过程中起重要的调控作用[5-7,22-27]。.第二章光皮桦BlKNOX基因表达分析与诱饵载体构建2.1材料与方法2.1.1实验材料（1）光皮桦5个KNOXcDNA全长由本实验室其他成员提供，测序结果正确。（2）Y2H、Y187菌株来自Clontech公司。（3）大肠杆菌DH5α为本实验室保存。（4）pGBKT7、pGBKT7-53、p

6、GADT7-T、pGBKT7-Lam、pGADT7-T购自Clontech公司2.1.2试剂HiFiTaq酶，PCRbuffer，dNTPs，DNA限制性内切酶，DNALigationKit，琼脂粉，葡萄糖，胰蛋白胨，酵母提取物，氯化钠，琼脂糖，二甲亚砜（DMSO），二甲基甲酰胺（DMF），PEG3350，LiAc，核酸凝胶回收试剂盒，质粒DNA纯化试剂盒，氨苄青霉素粉末，DNA纯化试剂盒，卡纳青霉素粉末，快速酶切酶等试剂均购自TaKaRa。酵母质粒提取试剂盒购自OMEGA公司。In-FusionHDCloingKit，X-α-Gal，Aureob

7、asidinA（AbA），SDMinimalmedium，-LeuDOSupplment，-TrpDOSupplment，-Leu/-TrpDOSupplment，-Leu/-Trp/-His/-AdeDOSupplment等试剂购自Clontech公司。.2.2结果与分析基于转录组序列，以cDNA为模板，克隆光皮桦KNOX基因，结果获得5个不同序列，分别命名为BlKNOX1-BlKNOX5。采用EditSeq分析，结果显示BlKNOX1-BlKNOX5这5个基因的ORF长度分别为927bp，858bp，960bp，1131bp和1362bp。通过Blast对

8、分析光皮桦KNOX基因结构域进行分析，