荧光原位杂交技术及其在植物学中应用现状

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1、荧光原位杂交技术及其在植物学中应用现状荧光原位杂交是Langer在1982由原位杂交改善而来[1]，其基本原理为：根据核苷酸碱基互补配对原则，使荧光标记的探针序列与靶DNA序列进行杂交，然后用合适的检测方法将荧光信号检出，达到基因定位的目的。因其具有灵敏度高、特异性强、定位准确、快速有效、安全直观等特点而被应用于很多领域。自从1985年Raybm[2]首次将原位杂交技术应用于植物染色体研究后该技术便在植物学研究中得到了广泛的应用。1荧光原位杂交技术的发展与改进荧光原位杂交是在放射性同位素原位杂交的基础上改进而来的，Manning等[3]在1975年最早用非放射性的生物

2、素通过细胞色素C与RNA分子链接，开创了非放射性标记，Rudkin等1977年在放射性同位素标记的基础上发明了用间接免疫荧光法检测目的DNA的非同位素原位杂交技术，Langer等在1982年成功地实现了首例用生物素标记探针的原位杂交，自此荧光原位杂交技术真正建立并不断发展改进。随着分子生物学技术的发展，FISH技术还衍生出了引物原位标记、间期核FISH、染色体原位抑制技术等，并且还发展出M-FISH、3D-FISH、Rx-FISH技术、CGH5以及近年来微阵列技术等这些更为完善的FISH技术。1.1FISH中探针的发展改进特异探针序列的正确选择是FISH技术中的一个关

3、键，随着FISH技术发展，针对不同的研究对象和目的，探针的类型也有了许多改进，主要有以下几种：1）染色体特异重复序列探针：rDNA、端粒、着丝粒以及类似于α卫星、卫星Ⅲ等重复序列上重复元件可达106拷贝数，其杂交靶位点大于1Mb，杂交信号易于检测，常用于检测非整倍体；2）基因组探针：高等动物基因组DNA除过很小一部分的编码序列外有一些高频率的重复序列，进化上的保守性使其具有物种特异性，作为探针，可分析多倍体的起源、进化、基因组成等；3）单拷贝序列探针：针对靶片段中的单拷贝序列而选择的此类探针，通常是某个基因的DNA克隆、RFLP或RAPD标记或是用大的插入片段；4）染

4、色体文库探针：此类探针由从基因组文库中的一条染色体或某一区域核酸片段组成，片段较小，因此被破坏的可能性小。用于鉴定染色体的易位与畸形以及分析中期染色体重组和间期核结构；5）RNA探针：RNA探针敏感性强，不需要变性，就可形成比DNA探针紧密的杂交体。RNA探针包括的ssRNA探针和寡核苷酸RNA探针两种。1.2FISH中靶的发展与改进5在FISH中根据不同目的不同对象确定靶片段的类型是提高分辨率的关键因素，靶目标的类型有以下几类：1）中期染色体：此时期染色体可以通过简单的染色体制片技术获得，但因其高度凝缩，分辨率只能达到1Mb～3Mb的水平；2）粗线染色体：处于减数分

5、裂的粗线期染色体浓缩程度比中期低得多，而且Jiming等人证实用玉米粗线期染色体固定于4%福尔马林可以使染色体伸长到原来的20倍[4]，进而提高了FISH分辨率；3）间期细胞核：处于间期的细胞核染色质浓缩程度比粗线期低，因此其分辨率相对较高；4）游离染色质：处理细胞核释放出游离染色质，进一步降低DNA的浓缩程度，这种方法能有效地将分辨率提高到1Mb范围内；5）DNA纤维：伸长的DNA纤维是裸露的DNA分子，暴露出更多的杂交位点，更大程度的提高了分辨率，具有高效快速直接的优点。此外Valfirik等[5]发展了一种超伸展的流式分拣植物染色体FISH技术，大大提高了FIS

6、H的分辨率。此方法可获得比中期染色体长100倍以上的伸展的染色体纤维，同时保持了染色体的完整性，用于某些方面的研究，比DNA纤维荧光原位杂交更具优势。1.3探针标记方法的发展与改进5FISH中探针的荧光标记方法是由放射性标记方法改进而来，可分为直接法和间接法两种。直接法是将荧光物直接与探针核苷酸的磷酸戊糖共价结合，杂交后简单冲洗即可检测。间接法是先在探针DNA上结合诸如生物素或地高辛等半抗原，杂交结束后再用标记有荧光素的相应半抗原的抗体进行检测，间接标记可分为PCR法、不依赖序列的扩增法、缺口平移法三种。直接法虽然操作简单，但信号放大程度不如间接法，灵敏度差一些，间接

7、法灵敏度高，应用较为广泛。早先的荧光标记只用一种颜色的荧光素，随着FISH技术的发展，在一次杂交种用多种探针多种荧光素的多彩FISH技术已成为可能。双标记的寡核苷酸探针荧光原位杂交可提高信号强度且不引起特异性问题还能增加rRNA可访问性。2FISH技术的应用2.1FISH在植物基因定位上的应用由于FISH技术可在同一张切片上同时观察几种DNA探针的定位，直接得到它们的相关位置和顺序，因而已广泛应用于生物基因组和功能基因定位研究[6]。王永等[7]利用FISH技术研究发现羽衣甘蓝2号染色体上存在3个5SrDNA串联重复位点，并且这3个位点都位于2号染色