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1、WAF1蛋白质稳定性N.terminalFlagTagStabilizesP21cIp1F'ProteinLUFeng-min,LIYa-juan,ZHUANGHuirDepartmentofMicrobiology,PekingUniversityHealthScienceCenter,Being100083,China)O■变■童寞变■■■N一端加flag标签增加P21cipAF蛋白质稳定性鲁凤民/李雅娟/庄辉(北京大学医学部病原生物学系,北京100083)【摘要】背景与目的:已知细胞分裂周期抑制因子P21通过蛋白酶体通路降解,其氨基端的泛素化可能参与了这一过程.Flag为一蛋白
2、标签,常用于标记重组蛋白质,以便对靶蛋白进行生物学功能分析.本文旨在研究N_端加flag对P21蛋白质稳定性的影响.材料与方法:建立稳定表达外源flag-p21蛋白质的NIH3T3细胞株,应用蛋白印迹法(WB)检测NIH3T3细胞表达的flag-p21,并比较其与内源P21蛋白质半衰期的差异;确定阻断蛋白酶体水解通路对其降解过程的影响.结果:NIH3T3细胞表达的内源P21蛋白质半衰期约30min,而同一细胞表达的flag-p21融合蛋白半衰期则明显延长;用抑制剂MC,-132阻断蛋白酶体水解通路后,1'21蛋白质的量明显增加,但同一细胞内表达的flag-p21量却无明显改变.结论:
3、N-端加flag标签可增加P21蛋白质的稳定性.在对P21蛋白质的生物学功能进行研究时,应考虑N_端加flag对P21泛素化一蛋白酶体依赖的降解过程的影响.【关键词】P21帅;nag标签;蛋白酶体;降解中图分类号:R73文献标识码:A文章编号:1004—616X(2006)02—0119—03[ABSTRACT]BACKGROUND&A蹦:N-terminalubiquitinationmayplayaroleinp21'WAFIdegradationviaproteasome-dependentproteolyticpathway.Westudiedtheinfluence
4、ofaddingaN-terminalflagtagonthestabilityofp21protein.MATERIALANDMETHODS:NIH3T3cellstablyexpressingflag-p21wassetupbyretroviruspWB3flag-p21infectionfollowedbyBlasticidinselection.Half-lifeofp21proteinwastestedbywesternblotwithrabbitpolyclonalanti-p21antibody,andproteasomeinhibitorMG-132Wasemploy
5、edtotesttheroleofproteasomepathwayonthedegradationofp21protein.RESULTS:Half-lifeofendogenousp21inNIH3T3cellsWasabout30minutes,whilethehalf-lifeofexogenousflag-p21fusionproteinexpressedinthesalTletestedcellswasobviouslyincreased.AlthoughMG-132significantlyincreasedtheamountofendogenousp21protein
6、,thereWasnodetectablechangeofflag-p21expressionundertheSaBlecondition.CONCLUSION:N-terminalubiquitinationgvasnecessaryforeffectivep21proteasome-dependentdegradation.Thataddingflagtagattheaminoacidterminimaystabilizep21proteinshouldbeconsidered.f腰ywotmslP21cipt;flagtag;proteasome;degradationP21i
7、p'(简称P21)最早是通过免疫共沉淀发现的,可与CDK2结合并抑制CDK2激酶的蛋白质(CDKinhibitedprotein,Cip1)….P21还是野生型P53的下游作用因子(wild-typeP53activefactor,wAF1)….已知的P21蛋白质的功能包括调控细胞分化,衰老和抑制收稿日期:2005—10—12;修订日期:2005—12一O1作者简介:鲁凤民(1963一),男,河南省平顶山市人,副教授,博士,研究方向:肿瘤细胞生物学,病毒学
