药疹病人eb病毒和人疱疹病毒6型感染检测论文

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1、药疹病人EB病毒和人疱疹病毒6型感染检测论文杨婷婷朱桂芝陈官芝罗兵【摘要】目的探讨EB病毒（EBV）和人疱疹病毒6型（HHV6）感染在药疹发生中的作用。方法采用PCRSouthernblotting检测药疹病人和正常对照组外周血单个核细胞中EBVDNA；采用巢式聚合酶链反应检测HHV6DNA，并对HHV6阳性标本进行酶切分型；采用ELISA法检测EBVVCAIgM；采用RTPCRSouthernblotting检测EBV即刻早期基因BZLF1mRNA。结果药疹病人EBVDNA阳性率(77.42%，24

2、/31)明显高于正常对照组（χ2=77.84，P0.01），但HHV6阳性率（32.26%，10/31）与正常对照组比较差异无显著性（χ2=3.00，P0.05）。10例HHV6阳性药疹病人全部为HHV6A亚型，未检测到HHV6B亚型；而正常对照组73例HHV6阳性标本中有13例为HHV6A亚型。药疹病人EBVVCAIgM阳性率（19.34%.freelRNA阳性病人中有4例检出HHV6DNA，药疹病人BZLF1mRNA检出率与HHV6有明显的相关性（r=0.45，P0.05）。结论药疹病人存在EBV的活动

3、性感染，且EBV和HHV6可能有相互激活作用。【关键词】药疹；疱疹病毒4型,人；疱疹病毒6型,人［ABSTRACT］ObjectiveTostudytheroleofEpsteinBarrvirus(EBV)andHumanHerpesvirus6infectionindrugeruptionpatients.MethodsEBVDNAalcontrolbyPCRSouthernblotting,andHHV6DNAbynestedpolymerasechainreation,thepositives

4、amplesRNAples.ResultsThepositiverateofEBVDNA(24/31,77.42%)inthepatientsalcontrol(χ2=77.84,P0.01),butthedifferenceofHHV6alcontrol,HHV6Asubtypealcontrol(χ2=4.61,.freelRNApositive,fourRNAaticallycorrelatedayexistEBVandHHV6.［KEYgCl21.5mmol/L，dNTP0.2mmol/L，上下游引物

5、各0.5μmol/L，TaqDNA聚合酶1.0U，DNA模板4μL。扩增条件为：94℃预变性5min；然后，94℃30s，58℃30s，72℃45s，扩增35个循环；最后72℃延伸5min。以外侧引物的PCR产物为模板进行内侧PCR扩增反应，内侧PCR反应体积25μL，反应体系包括10×Buffer3μL，MgCl2终浓度1.5mmol/L，4×dNTP为0.2mmol/L，TaqDNA聚合酶1U，内侧引物浓度0.5μmol/L，外侧PCR产物2μL。扩增条件为：94℃预变性5min；然后，94℃变性30s，

6、56℃复性30s，72℃延伸45s，共35个循环；最后72℃延伸5min。取8μL内侧PCR产物于含溴化乙锭的琼脂糖凝胶中电泳，凝胶成像系统观察电泳结果，外侧PCR扩增产物长为287bp，内侧PCR扩增产物长为163bp，同时以HHV6GS株为阳性对照，阴性对照为HHV6阴性JJhan细胞系。1.2.4HHV6的PCR产物酶切分型取HHV6内侧PCR阳性扩增产物（163bp）用限制性内切酶HindⅢ进行酶切分析。反应体积为20μL，反应体系包括10×Buffer2μL，PCR产物10μL，HindⅢ10U，

7、去离子水补充体积至20μL，置37℃水浴消化12～16h。取酶切产物10μL于120g/L聚丙烯酰胺凝胶进行垂直电泳（80V，90min），凝胶用溴化乙锭（0.5mg/L）染色20min，凝胶成像系统观察电泳结果。1.2.5EBVVCAIgM抗体检测采集受检者外周血的分离血清，采用ELISA法检测EBV衣壳抗原（VCA）特异性IgM抗体，诊断试剂盒购自德国NOVATEC公司。具体方法参照试剂盒说明进行，对阳性标本进行重复实验。1.2.6PCRSouthern检测EBVDNAPCR反应总体积为25μL，反应

8、体系为：10×Buffer2.5μL，MgCl21.5mmol/L，dNTP0.2mmol/L，上下游引物各0.5μmol/L，TaqDNA聚合酶1.0U，DNA模板3μL，同时设立阳性对照和阴性对照，阳性对照为EBV阳性细胞系B958，阴性对照为EBV阴性细胞系Ramos细胞。扩增条件为：94℃预变性5min；然后，94℃30s，55℃30s，72℃45s，共扩增35个循环；最后72℃延伸5mi