哮喘小鼠肺内cgrp免疫反应阳性神经纤维的变化论文

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1、哮喘小鼠肺内CGRP免疫反应阳性神经纤维的变化论文.freela;calcitoningene-relatedpeptide;nervefibers;immunohistochemistry;mouseAbstract:AIMToinvestigatethechangesofdistributionofthecalcitoningenerelatedpeptide（CGRP）inthelungsofasthmaticmice.METHODSThemiceagroupandcontrolgroup.Immunohistochemistryandputerimagea

2、nalysisbersofCGRP-IRpositivefibersinairagroup.Thepositivefiberserginglikeastringofbeads.freeloothmusclelayerandbasementmembrane.Inaddition，nudeCGRP-IRpositivefibersucosa.Thenumbersofpositivefiberagroup（P0.01）.CONCLUSIONThereiscloserela-tionshipbeta，aybeareasonforpersistenceandprogress

3、ofasthma.0引言近年来随着有关神经肽研究的不断深入，证实呼吸道广泛存在着神经肽网，神经肽与哮喘的发病关系日益受到国内外学者的关注.有研究表明，哮喘时患者肺泡灌洗液及血液CGRP含量明显高于对照组［1］，提示CGRP可能参与了哮喘的发病过程.然而对哮喘时CGRP增多的确切原因尚不清楚.已知CGRP在肺内尤其在粘膜及粘膜下主要分布于迷走神经传人纤维内，通过轴索反射释放或迷走反射能导致血管扩张、通透性增加、炎性细胞尤其是嗜酸性细胞在气道周围浸润.含CGRP纤维在肺内分布多寡或（和）其活性增高可能是造成气道高反应性的原因之一.我们应用免疫组织化学方法结合图像分析技

4、术研究了哮喘时肺内CGRP免疫反应（CGRP-IR）阳性纤维的分布和形态改变，为探明哮喘的机制提供实验依据.1材料和方法1.1材料成年雄性BALB/c小鼠20只，体质量18～20g，本校实验动物中心提供.随机分为2组，即哮喘组和对照组.1.2方法①哮喘组按文献［2］复制小鼠哮喘动物模型，即实验的第0日腹腔内注射100gL-1卵白蛋白0.2mL;第15日开始吸入10gL-1卵白蛋白气溶胶30min，每日1次，连续14d.对照组用生理盐水代替卵白蛋白.②于实验第30日以戊巴比妥钠（40mgkg-1，ip）麻醉豚鼠，开胸经主动脉灌注10mL生理盐水，继以新配制的4℃40

5、gL-1多聚甲醛PB溶液（0.1molL-1，pH7.4）50mL持续灌注10min，取出肺脏，4℃40gL-1多聚甲醛后固定24h，入200gL-1蔗糖PB溶液中，4℃过夜.③HE染色:恒冷箱切片，片厚8μm，贴片于10gL-1明胶+50mgL-1硫酸铬钾处理过的载玻片上，室温干燥30min后，常规HE染色.④免疫组织化学染色，片厚14μm，贴于载玻片上，室温干燥30min后，以0.01molL-1KPBS（pH7.4）浸洗，经800mLL-1甲醇+30mLL-1H2O2封闭15min，入30mLL-1TritonX-100中30min，KPBS浸洗3×10mi

6、n，切片入兔抗CGRP血清（1∶4000，Onco-geneScience）室温孵育24h.KPBS浸洗3×10min，入结合生物素的羊抗兔IgG血清（1∶500，Sigma），室温孵育3h，KPBS浸洗3×10min，入ABC复合物（1∶500，Sigma）室温孵育2h.葡萄糖氧化酶-DAB-硫酸镍胺法显色.显色反应终止后，常规脱水透明，DPX封片.⑤图像分析:以肺内气道为分析对象，显微镜下图像分析，测量单位玻片面积内CGRP-IR阳性纤维条数.统计学处理:按均数和标准差进行两组t检验.2结果2.1正常及哮喘小鼠肺组织HE染色与正常组相比哮喘组可见气道平滑肌外层

7、、粘膜下层和外层可见大量炎性细胞浸润（Fig1），粘膜杯状细胞增多（Fig2），大气道周围形成较多的淋巴样结节组织，可见大量嗜酸性细胞，支气管平滑肌增厚，管壁环行肌肥大.2.2正常小鼠呼吸道CGRP┐IR阳性纤维分布特点从支气管至终末细支气管和肺血管均可见CGRP-IR阳性纤维分布，而呼吸性细支气管和肺泡则未见阳性纤维.其分布特点是:①纤维主要分布于基底膜下及平滑肌外层周围;②主要分布于肺内支气管气道粘膜下层（Fig3）及细支气管粘膜下层（Fig4）及平滑肌层，随气道口径的变小，纤维密度逐渐减少;③纤维稀疏，呈串珠样或节状膨体.2.3哮喘小鼠呼吸道CGRP┐IR阳

8、性纤维分布