栀子中京尼平苷的微生物转化研究论文

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1、栀子中京尼平苷的微生物转化研究论文王永宏，苏建，王建芳，廖勇，冯杉，孙启玲【摘要】目的通过筛选一株高产β葡萄糖苷酶菌株对栀子进行发酵，使得其中的京尼平苷转化为京尼平。方法通过底物特异显色筛选模型筛选菌株，并使用正交实验对发酵条件进行优化。结果筛选到一株产β葡萄糖苷酶酶活可达到8.2u/ml的青霉Penicilliumnigricans.freelinoidesEllis)entationprocessbyβglucosidasestraintotransformgeniposideintogenipin,amoreeffectivepound.MethodsThemodel

2、ofspecificcolorizingentationprocessizedbyanorthogonallayout.ResultsThroughthemodelofspecificcolorizing,thestrainicrobialtransformationhasbeenscreened.Thetransformationratecouldreachto95%.Itedintogenipinbythemethodofmicrobialtransformation.Keyinoides;Geniposide;Penicilliumnigricans；Genipin;Mic

3、robialtransformation栀子是茜草科（Rubiaceae）栀子属（Gardenia）植物，入药部分为其干燥成熟果实，性味苦寒，归心、肺、三焦经。主要具有保肝利胆之功效，药效成分是以京尼平苷为代表的环烯醚萜苷类，此外还含有有机酸类、色素类、挥发油等成分［1］。药代动力学研究发现，栀子有效成分京尼平苷的利胆作用是通过肠道微生物产生的β葡萄糖苷酶水解所生成的京尼平而引起的［1］。日本MieInao等对栀子治疗肝硬化的研究表明，京尼平苷的水解产物京尼平能够抑制肝脏星状细胞的活性而达到对肝硬化疾病的治疗［2］。同时，已有研究证明京尼平亦具有显著抗炎、抗脂质过氧化、抗血管生

4、成、抗NO生成［3］、抗淀粉β蛋白质的神经毒性等药效［4］，京尼平也是迄今为止所研究的环烯醚萜物质中抑制诱变剂诱变活性最强的物质［1］。京尼平还可被应用于生物材料的交联，它不仅能形成稳定的交联制品，同时具有细胞毒性小，生物相容性好，抗降解能力强和应用领域广泛等优点，是非常有前途的生物交联剂。京尼平在栀子中的含量很低，约为0.005%～0.01%，主要是以其前体形式京尼平苷形式存在，含量约为3%～5%。因此，利用微生物与中药栀子共发酵生产京尼平具有非常重要的意义。微生物转化栀子的原理即利用β葡萄糖苷酶的产生菌与栀子进行共发酵，在β葡萄糖苷酶的作用下，使京尼平苷的糖苷键断裂而生

5、成京尼平。本文利用一株产β葡萄糖苷酶的青霉Penicilliumnigricans与栀子共发酵，确立了发酵最优条件，进行了发酵动力学的研究，阐明了发酵过程中酶活变化与京尼平苷转化的关系，分离纯化了产物，并对产物进行了性质和结构鉴定。1材料与方法1.1材料菌种为本实验室从自然界分离得到，经鉴定为一株黑青霉Penicilliumnigricans，编号为MK-1。栀子果实购于成都同仁堂药店。京尼平购自安徽DELTA天然有机化合物信息中心。薄层色谱预制板硅胶G（福山生化试剂厂），其余试剂均为市售分析纯。GBRT全自控10L发酵罐(烟台高新区海洋生物工程研究所)，HQ45型恒温摇床（武

6、汉中科科仪技术发展有限责任公司），ShimadzuLC10AT高效液相色谱仪，Tu1800紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司），BioTOFⅢQ型质谱仪，BrukerAvance600型核磁共振仪，XT4显微熔点测定仪，BioRad，FTS175傅立叶红外分光光度计（美国伯乐公司产品）。1.2方法1.2.1菌种筛选以及鉴定方法初筛条件的确立：以1%的栀子煮提液做酶反应底物，配以土豆培养基配方形成初筛培养基，加入琼脂粉配制初筛平板，将待测菌株接入，25℃培养2d后，观察菌落周围的显色圈大小以确定京尼平苷转化活性［5］。菌种复筛：将初筛菌株接入土豆发酵培养基，发酵

7、4d后，离心得粗酶液，分别以5%的栀子煮提液为酶反应底物，0.1mol/L的甘氨酸为显色底物，加入琼脂粉配制复筛平板，点孔后，准确加入适当浓度的粗酶液5μl，40℃保温5h，观察显色圈。显色圈大小可反应转化率高低。通过菌落、菌丝体、孢子梗形态以及菌种的生理生化特征对筛选到的菌种进行了鉴定。1.2.2TLC法分析采用硅胶G（20cm×10cm）薄层色谱板，展开剂为醋酸乙酯：石油醚（1∶1），显色剂为用0.1mol/L，pH7.0的磷酸缓冲液配制成的0.44mmol的甘氨酸溶液。1.