利用辅助激光解析电离质谱用于多肽和蛋白质亚硝基化修饰研究的论文

《利用辅助激光解析电离质谱用于多肽和蛋白质亚硝基化修饰研究的论文》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、利用辅助激光解析电离质谱用于多肽和蛋白质亚硝基化修饰研究的论文【摘要】　　亚硝基阴离子是生物体内重要的生物调控小分子，广泛分布于生物体的血液和组织中，能使蛋白质发生硝基化和亚硝基化修饰，并且调控生物体的多种生理过程。本研究应用高灵敏度的基质辅助激光解析电离飞行时间串联质谱（malditofms）技术，以合成的标准肽段和肌红蛋白为模型系统。研究了蛋白质和多肽主链n端氨基与赖氨酸侧链氨基对ｈｎｏ２反应的敏感性，并考察了反应体系和不同的反应时间对ｈｎｏ２与多肽的反应完全程度的影响。结果表明，ｈｎｏ２能与肽段n端的伯氨基发生重氮化反应，形成的叠氮化中间产物不稳定，

2、放出氮气形成碳正离子，碳正离子可进一步发生取代或消除反应。发生取代反应，水溶液中的羟基取代n末端氨基形成m+1产物，既使得产物比原肽段分子量多1da；发生消除反应，脱掉1分子的氨，又生成m17烯烃衍生物，从而使产物比原肽段分子量少17da。当采用1mol/l乙酸和1mol/l的亚硝酸钠作为反应体系时，反应5min,肽段的n端氨基即可完全与ｈｎｏ２反应生成羟基取代产物和烯烃衍生物。而在上述条件下，未发现赖氨酸侧链氨基与ｈｎｏ２反应，说明ｈｎｏ２主要与肽段和蛋白的n端氨基发生反应。【关键词】基质辅助激光解析电离飞行时间质谱蛋白质亚硝化　　1引言　　亚硝酸盐被广泛

3、用于食品防腐添加剂。.cOm越来越多的研究证据表明:ｎｏ－２广泛分布于生物体的血液和组织中，并且调控生物体的多种生理过程［1～４］。亚硝酸盐的还原产物能使蛋白质发生硝基化和亚硝基化修饰［５］。ｈｎｏ２经酶或化学试剂还原可以产生一氧化氮（no），而no在生物体内具有多种功能，其中包括修饰蛋白质的自由巯基［５，６］。另外，no可以通过亚铁血红素相关化合物的氧化产生no2自由基，这种自由基能使蛋白质的色氨酸和苏氨发生硝基化修饰［７～1１］。ｈｎｏ２与胺的化学反应已经被广泛用于区分伯、仲、叔胺。而ｈｎｏ２与伯氨基的反应则主要是通过形成不稳定的叠氮化物中间产物，进而释放氮

4、气并形成碳正离子，最后碳正离子发生取代或消除反应形成最终的稳定产物［1２］。malin等［１３］应用氨基酸分析技术，发现亚硝酸盐能与聚赖氨酸发生反应，使赖氨酸侧链的氨基发生脱氨生成羟基正缬氨酸。muriguchi等［１４］报道蛋白质的n末端能被氧化亚氮修饰。然而，蛋白质和多肽主链n端氨基与赖氨酸侧链氨基对ｈｎｏ２反应的敏感程度目前还不清楚。本研究以合成的标准肽段和肌红蛋白为模型系统，首次应用高灵敏度的基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术研究蛋白质和多肽主链n端氨基与赖氨酸侧链氨基与ｈｎｏ２反应的敏感性。并考察了不同的反应体系和不同的反应时间对ｈｎｏ２与多肽和蛋

5、白质的反应完全程度的影响。　　2实验部分　　2．1仪器与试剂　　4800proteomicsanalyzer基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱仪(美国abi公司)，数据处理软件为dateexplorer(tm)softs1kv反射模式，20kv的加速电压，m/z700～3500的扫描范围，激光能量的设定值为4000,每张谱图累加1500次。马心肌红蛋白胰酶酶切肽段作为标准物对仪器进行外标校正,校准至误差≤0.1da，相对标准偏差≤10×10－6。脱盐小柱选用c18ziptip（promega公司）。　　马心肌红蛋白和α氰基4羟基肉桂酸购自美国sig

6、ma公司；标准合成肽段p1（氨基酸序列：kgaggaf,分子量：1550.1da）和p2（氨基酸序列：iyysmnvevtdk,分子量：1460.5da）由赛百盛公司合成；序列级胰蛋白酶购置于promega公司；二硫苏糖醇(dtt)购自usb公司；碘乙酰胺(iaa)购自nemol/lnh4hco3缓冲液(ph7.5),37℃孵育１２h;分装每管15μl(约1.5μg),－20℃冻存备用。取10μl上述肌红蛋白胰酶酶切肽段，加20μl1mol/lo甲基异脲（1mol/lnaoh溶液溶解），37℃反应4h,加1mol/l乙酸，调节ph为8左右，此时赖氨酸的侧链氨基

7、胍基化完全[15]，脱盐后进行质谱分析。　　2.2.2ｈｎｏ２与标准肽段的反应产物的鉴定分别取5μlp1、p2肽段溶液（1g/l）,加25μl1mol/lhcl,再加10μl1mol/lnano2溶液，反应1h，c18ziptip脱盐后，点靶，进行malditofms分析。　　2.2.3反应时间对反应完全程度的影响取5份5μlp1肽段（1g/l）,加25μl1mol/lhcl,再加10μl1mol/lnano2溶液，反应5min、20min、40min、1.0h和2.0h后，用c18ziptip脱盐点靶，进行malditofms分析。以质谱峰强度（i

8、1533＋i1551）/