杏丁注射液对血管内皮细胞hsp72表达的影响

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1、杏丁注射液对血管内皮细胞HSP72表达的影响【关键词】,杏丁注射液［摘要］目的：观察杏丁注射液对紫外线照射后血管内皮细胞热休克蛋白72（heatshockprotein72,HSP72）表达的影响。方法：采用体外培养的猪主动脉血管内皮细胞，以含浓度分别为0.1、0.5、1.0、5.0、10mg/ml的杏丁注射液的培养基培养72h后，用紫外线分别照射细胞30min，以ethods:Porcineaorticendothelialcellsediumsg/ml)ofXingdingInjection.Ultravioletradi

2、ationinisteredtotheculturedcellsfor30minutes.199培养基，购自GibcoBRL公司；肝素和内皮细胞生长支持物，美国Sigma公司产品；丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺、甘氨酸、三羟甲基氨基甲烷（Trisbase）、十二烷基磺酸钠、四甲基乙二胺、二硫苏糖醇、苯甲基磺酰氟，Promega公司产品；兔抗猪HSP72、辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase,HRP)标记羊抗兔IgG和异硫氰酸荧光素标记羊抗兔IgG，北京中山生物公司产品；总蛋白质定量试剂盒，BioRad公司产品。

3、其余均为国产试剂。　　1.1.2仪器YJ1450型医用净化工作台，哈尔滨净化设备公司；CO2孵箱，Forma公司；倒置显微镜、荧光显微镜（BX60型），Olympus公司；高速低温离心机，Sigma公司；199培养液冲洗动脉管腔1～2遍，一并合入离心管，1000r/min离心10min，去上清，用含20%胎牛血清培养液重新悬浮细胞，调细胞密度至1.5×105～2.0×105个/ml，接种于50ml培养瓶，加入4ml培养液（培养液中含青霉素200U/m1、链霉素200U/ml、两性霉素B2.5μg/ml、肝素15U/ml、内皮细

4、胞生长支持物30μg/ml），于37℃、5%CO2孵箱中培养。待细胞贴壁后，换含10%胎牛血清的M199培养液继续培养，细胞融合成片后即可传代培养。内皮细胞采用普通光学显微镜观察法和免疫荧光法检测第Ⅷ因子抗原表达阳性确定为内皮细胞。　　1.2.2分组及给药将内皮细胞平均分为6组，即空白对照组和0.1、0.5、1.0、5.0、10mg/ml的杏丁注射液组，每组８孔。将每孔的原培养基吸出，分别用不同的培养基200μl，即空白组用不含杏丁注射液的Ｍ199培养基，其余各组分别用含杏丁注射液0.1、0.5、1.0、5.0、10mg/ml

5、的M199培养基，于37℃培养72h后，将生长细胞的6孔板置于超净工作台中，应用紫外光源垂直照射细胞30min，光源距离培养基约30cm。　　1.2.3细胞总蛋白提取及蛋白定量收集各组细胞，计细胞总数并调至一致，6000r/min离心5min，4℃PBS（pH7.4）清洗1次，弃上清并尽量吸干。根据细胞总数按20000个细胞１μl的比例，加入冰冷的悬浮缓冲液，迅速混匀，于4℃裂解30min，此时细胞由于破膜和DNA释放将会很黏稠，然后将裂解物于16000r/min离心10min，取上清即为提取的细胞总蛋白，以BioRad公司D

6、CProteinAssayKit进行蛋白定量。　　1.2.4in，室温冷却，按文献［1］报道的in；二抗为相应的辣根过氧化物酶标记IgG，用脱脂奶粉按1∶2000稀释，37℃孵育1h；二抗孵育后的NC膜以TBS洗3次后用化学发光法（ECL试剂盒，Amersham公司）显色，倒去洗液后加入化学发光试剂，室温反应1～3min，NC膜移至暗室，暗盒曝光适当时间，取出胶片冲洗。　　1.3统计学方法用GelProAnalyzer3.0软件对Westernblot蛋白质条带进行定量，用SPSS11.0软件做统计学处理，实验数据用x±s表示

7、，均数间的比较用t检验。　　图1主动脉内皮细胞形态(×100)（略）　　Fig1Configurationofaorticendothelialcells(×100)　　图2内皮细胞第Ⅷ因子相关抗原表达阳性(×400)（略）　　Fig2PositiveexpressionoffactorⅧrelatedantigenofendothelialcells(×400)　　2.3各组内皮细胞HSP72的表达未经紫外线照射的情况下，各组均未检测到内皮细胞HSP72的表达。经紫外线照射的各组，随杏丁注射液剂量的不同HSP72表达水平有所

8、改变。与对照组相比，低剂量组（0.1mg/ml）HSP72表达已有明显增加（P<0.05）；在中剂量（0.5、1.0mg/ml）时，HSP72的表达较对照组明显升高（P<0.01）；高剂量（5.0、10mg/ml）则又呈下降趋势，且与对照组相比无明显升高（P>