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《cu（ⅱ）螯合壳聚糖磁性微球固定化胃蛋白酶的制备及性能研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。
1、Cu（Ⅱ）螯合壳聚糖磁性微球固定化胃蛋白酶的制备及性能研究囵2007,VoI.24No.10亿亏与生物互程Chemistry&BioengineeringCu【11)螯合壳聚糖磁性微球固定化胃蛋白酶的制备及性能研究刘峥.王丽娟.覃庆敏.王莉(桂林工学院材料与化学工程系,广西桂林541004)摘要:将Cu(Ⅱ)螯合壳聚糖磁性微球用作固定化胃蛋白酶的载体,讨论了固定化时间,pH值和给酶量对酶固定化的影响.确定最适固定化条件为:固定化时间1.0h,pH值4～5,给酶量15Omg?(g载体).与自由酶比较,固定化胃蛋白酶的催化特性和稳定性均令人满意关键词:Cu(Ⅱ)
2、螯合壳聚糖;磁性微球;固定化胃蛋白酶;制备;性能中图分类号:Q814文献标识码:A文章编号:1672—5425(2007)10～0052～04当前酶的固定化方法很多],但真正投入到工业化应用的并不多.开发更简便,高效,适用的酶固定化方法和性能更优异的酶固定化载体是研究重点.金属离子螯合技术已引起了酶固定化研究者的关注,并进行了尝试.作者在此将Cu(11)螯合壳聚糖磁性微球用作固定化胃蛋白酶的载体,讨论了固定化酶的影响因素及其性能.l实验1.1试剂与仪器胃蛋白酶,国药集团化学试剂有限公司;酪蛋白,上海试剂厂;CuC1:?2H(),南召化工厂;Cu(11)螫合壳聚糖磁性
3、微球,自制.DL-20A型数控超声波清洗器,上海之信仪器有限公司;DZF_6020型真空干燥箱,上海一恒科学仪器有限公司;UV-2450型紫外分光光度计,13本SHIMADZU;80-2型离心沉淀器,上海分析器械厂;THZ-82型数显水浴恒温振荡器,江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司.1.2胃蛋白酶的固定化方法取0.5g磁性金属螯合载体,加入5.0mL胃蛋白酶溶液,室温下振荡30min,使胃蛋白酶固定于载体上,用乳酸一乳酸钠缓冲溶液洗涤数次,直至上清液中检测酶活为零,即得磁性金属螯合载体固定化胃蛋白酶.载酶量按下式计算:载酶量一Ill0式中,m.为磁性载体的质量,g;
4、为加入酶的质量,rag;.为上清液中剩余酶的质量,mg.1.3胃蛋白酶的定量分析准确称取一定量的牛血清白蛋白,溶于乳酸一乳酸钠缓冲溶液(pH值4.0)中,配制成牛血清白蛋白的标准溶液,以乳酸一乳酸钠缓冲溶液为参比溶液,分别测定不同浓度牛血清白蛋白溶液于278nm处的吸光度值,绘制牛血清白蛋白的标准工作曲线,用于后续酶含量测定.1.4酶活性分析j1.4.1酪氨酸工作曲线的绘制精确称取在105oC下干燥至恒重的标准酪氨酸0.0110g,慢慢加入乳酸一乳酸钠缓冲溶液(pH值4.0)使其溶解,定容至100mI,其浓度为110g?mi.以乳酸一乳酸钠缓冲溶液为参比溶液,测定不
5、同浓度酪氨酸溶液在274nm处的吸光度值,绘制酪氨酸的标准工作曲线,用于后续酶活的测定.1.4.2自由酶活性的测定取1mL酶液和5mL1酪蛋白溶液(pH值4.0)摇匀,置于10mL的试管.在40℃搅拌反应30min后,加入2mL10的三氯乙酸,反应混合物在室温下离心分离30min后,吸取上层清液,在274nm处测定吸光度值.参比液配制:移取5mL1酪蛋白溶液(pH值4.0),加入2mi10的三氯乙酸去除溶液中的酪蛋白,离心分离,吸取上清液为参比液.以这样的溶液为参比,就能很好地扣除酪蛋白溶液酶解前所含酪氨酸的量.自由酶的总活力定义为:一定量胃蛋白酶每分钟水解产生的酪
6、氨酸的量,用p-g?min表示.收稿日期:2006～07～17作者简介:刘峥(1962一),女,江西人,教授,研究方向:功能材料的制备及应用.刘峥等:Cu(1I)螯合壳聚糖磁性微球固定化胃蛋白酶的制备及性能研究/2007年啊l0期1.4.3固定化酶活性的测定称取一定量的固定化酶与5roLl%的酪蛋白(pH值4.0)混匀,置于10mL的试管,酶与底物在40℃下搅拌30min,进行磁性分离,然后加入2mL10%的三氯乙酸,反应混合物在室温下离心分离30min后,吸取上层清液,以5roLl酪蛋白溶液(pH值4.0,加入2mL10的三氯乙酸去除其中的酪蛋白)为参比液,在27
7、4nrfl处测定吸光度值.固定化酶的总活力定义为:一定量磁性固定化酶每分钟水解产生的酪氨酸的量,用g?min表示.固定化酶的比活力定义为:每克磁性固定化酶每分钟所产生的酪氨酸的量,用g?min?g表示.2结果与讨论2.1胃蛋白酶的固定化条件选择2.1.1固定化时间对酶固定化的影响平行取5份0.5g的磁性载体,恒定其它条件,分别固定化0.25h,0.5h,1.0h,2.0h,3.0h,对载体的载酶量和固定化酶的活力进行测试,结果见图1.∞-:g●毒蝗.0~1'~7/h图1固定化时间对酶固定化的影响Fig.1Effectoftimeonenzymeimmobiliz
