胰蛋白酶在胰腺癌疼痛中的作用

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1、胰蛋白酶在胰腺癌疼痛中的作用【关键词】胰蛋白酶；胰腺肿瘤；疼痛；蛋白酶活化受体-2Abstract：ObjectiveTostudythetrypsinexpressioninpancreatictumorspecimenfrompancreaticcarcinomapatientsRNAanditsexpressioninfreshtissuespecimenfromthepancreaticcarcinomapatientsulation)score≥5.ResultsThemRNAlevelatissuethaninno

2、malpancreatictissue.AndouteofELISAshoatissuesignificantlyincreasedparedalpancreatictissue(P<0.05).ConclusionHighexpressionoftrypsinisfoundinpancreaticcarcinomapatientsaymediatenociceptionbyactivationofprotease-activatedreceptor-2inprimarysensoryneurons.Keya;pain;

3、protease-activatedreceptor-21991—2000年来，中国胰腺癌病死率水平在不断上升，65岁以上人群尤为明显［1］。胰腺癌患者发生疼痛极为常见，胰腺癌患者的疼痛发生率及其严重程度与肿瘤程度相关，约30%~60%病灶相对局限的早期胰腺癌患者和逾80%的进展期胰腺癌患者有癌痛体验，患者死亡前的癌痛发生率更高达90%。胰蛋白酶(Trypsin)为蛋白酶的一种，在胰脏是作为酶的前体胰蛋白酶原而被合成的，是肽链内切酶，它能把多肽链中赖氨酸和精氨酸残基中的羧基侧切断。它不仅起消化酶的作用，而且还能限制分解糜蛋白酶

4、原、羧肽酶原、磷脂酶原等其他酶的前体，起活化作用。胰蛋白酶还可激活蛋白酶活化受体-2(protease-activatedreceptor，PAR-2)，近年来，发现蛋白酶活化受体-2可能介导胰腺炎的疼痛［2］，给清醒大鼠胰管内注入胰蛋白酶和PAR-2特异性肽激动剂均可以引起疼痛行为反应。在胰腺炎症时，胰腺组织胰蛋白酶可激活PAR-2，在胰腺癌发生时，是否同样具有蛋白酶的高表达呢？为此，我们选取东方肝胆外科医院确诊的胰腺癌病例，视觉模拟疼痛评分(VAS)在5分以上的胰腺肿瘤患者的新鲜组织标本，对胰蛋白酶的mRNA及其蛋白的表达

5、进行检测，以验证胰蛋白酶是否高表达，并激活PAR-2引起胰腺癌疼痛。1材料与方法1.1实验材料选取人胰腺癌患者的肿瘤新鲜组织。人胰蛋白酶ELISA试剂盒为武汉中美科技有限公司产品。考马斯亮蓝试剂盒为南京建成生物工程研究所产品。RT-PCR试剂盒为德国Qiagen公司产品。Tag酶为美国BioLabs公司产品。1.2标本的选取及分组分为两组，实验组10例为胰腺癌组，视觉模拟疼痛评分(VAS)在5分以上；对照组10例为正常胰腺组织组。1.3RT-PCR方法检测人胰蛋白酶mRNA的表达人胰蛋白酶基因序列(NM-002771.2)由G

6、enebank获得，据其序列特点，设计引物序列如下：5-CATGTTCTGTGTGGGCTTCCT-3；5-GTAGACCTTGGTGTAGACTCC-3。取预标本匀浆，加入Trizol试剂1ml，振荡15s混匀后，加入酚200μl，混匀，加入氯仿：异戊醇溶液200μl，混匀。4℃，15000r/min离心10min，抽取上清入新管；加入400μl氯仿：异戊醇溶液，混匀后4℃，15000r/min离心10min，抽上清入新管，用500ml异丙醇室温下沉淀10min，4℃，15000r/min离心10min，弃上清，用70%乙醇

7、溶液1ml清洗2次，溶解于Milliq水50μl中，分光光度计检测浓度和纯度-80℃低温保存。而后以上述引物行RT-PCR，解链温度为54℃，进行30个循环。1.4ELISA检测人胰蛋白酶水平的变化取正常胰腺组织及胰腺癌组织，匀浆后考马斯亮蓝测定总蛋白，采用双抗体夹心ABC-ELISA法检测，将抗人胰蛋白酶单抗包被于酶标板上，标准品和样品中的人胰蛋白酶与单抗结合，加入生物素化的抗大鼠人胰蛋白酶，形成免疫复合物连接在板上，辣根过氧化酶标记的Streptavidin与生物素结合，加入酶底物OPD，出现黄色，加终止液硫酸，颜色变深，

8、在450nm处测OD值，人胰蛋白酶浓度与OD值成正比，可通过绘制标准曲线求出标本中人胰蛋白酶浓度。1.5统计学方法计量资料以均数±标准差表示，用SAS6.12统计软件进行分析，数据比较均采用近似F检验（SNK-q），P<0.05具有统计学意义。图1RT-PCR示胰腺及胰