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时间:2018-07-07
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1、胰蛋白酶在胰腺癌疼痛中的作用【关键词】胰蛋白酶;胰腺肿瘤;疼痛;蛋白酶活化受体-2Abstract:ObjectiveTostudythetrypsinexpressioninpancreatictumorspecimenfrompancreaticcarcinomapatientsRNAanditsexpressioninfreshtissuespecimenfromthepancreaticcarcinomapatientsulation)score≥5.ResultsThemRNAlevelatissuethaninno
2、malpancreatictissue.AndouteofELISAshoatissuesignificantlyincreasedparedalpancreatictissue(P<0.05).ConclusionHighexpressionoftrypsinisfoundinpancreaticcarcinomapatientsaymediatenociceptionbyactivationofprotease-activatedreceptor-2inprimarysensoryneurons.Keya;pain;
3、protease-activatedreceptor-21991—2000年来,中国胰腺癌病死率水平在不断上升,65岁以上人群尤为明显[1]。胰腺癌患者发生疼痛极为常见,胰腺癌患者的疼痛发生率及其严重程度与肿瘤程度相关,约30%~60%病灶相对局限的早期胰腺癌患者和逾80%的进展期胰腺癌患者有癌痛体验,患者死亡前的癌痛发生率更高达90%。胰蛋白酶(Trypsin)为蛋白酶的一种,在胰脏是作为酶的前体胰蛋白酶原而被合成的,是肽链内切酶,它能把多肽链中赖氨酸和精氨酸残基中的羧基侧切断。它不仅起消化酶的作用,而且还能限制分解糜蛋白酶
4、原、羧肽酶原、磷脂酶原等其他酶的前体,起活化作用。胰蛋白酶还可激活蛋白酶活化受体-2(protease-activatedreceptor,PAR-2),近年来,发现蛋白酶活化受体-2可能介导胰腺炎的疼痛[2],给清醒大鼠胰管内注入胰蛋白酶和PAR-2特异性肽激动剂均可以引起疼痛行为反应。在胰腺炎症时,胰腺组织胰蛋白酶可激活PAR-2,在胰腺癌发生时,是否同样具有蛋白酶的高表达呢?为此,我们选取东方肝胆外科医院确诊的胰腺癌病例,视觉模拟疼痛评分(VAS)在5分以上的胰腺肿瘤患者的新鲜组织标本,对胰蛋白酶的mRNA及其蛋白的表达
5、进行检测,以验证胰蛋白酶是否高表达,并激活PAR-2引起胰腺癌疼痛。1材料与方法1.1实验材料选取人胰腺癌患者的肿瘤新鲜组织。人胰蛋白酶ELISA试剂盒为武汉中美科技有限公司产品。考马斯亮蓝试剂盒为南京建成生物工程研究所产品。RT-PCR试剂盒为德国Qiagen公司产品。Tag酶为美国BioLabs公司产品。1.2标本的选取及分组分为两组,实验组10例为胰腺癌组,视觉模拟疼痛评分(VAS)在5分以上;对照组10例为正常胰腺组织组。1.3RT-PCR方法检测人胰蛋白酶mRNA的表达人胰蛋白酶基因序列(NM-002771.2)由G
6、enebank获得,据其序列特点,设计引物序列如下:5-CATGTTCTGTGTGGGCTTCCT-3;5-GTAGACCTTGGTGTAGACTCC-3。取预标本匀浆,加入Trizol试剂1ml,振荡15s混匀后,加入酚200μl,混匀,加入氯仿:异戊醇溶液200μl,混匀。4℃,15000r/min离心10min,抽取上清入新管;加入400μl氯仿:异戊醇溶液,混匀后4℃,15000r/min离心10min,抽上清入新管,用500ml异丙醇室温下沉淀10min,4℃,15000r/min离心10min,弃上清,用70%乙醇
7、溶液1ml清洗2次,溶解于Milliq水50μl中,分光光度计检测浓度和纯度-80℃低温保存。而后以上述引物行RT-PCR,解链温度为54℃,进行30个循环。1.4ELISA检测人胰蛋白酶水平的变化取正常胰腺组织及胰腺癌组织,匀浆后考马斯亮蓝测定总蛋白,采用双抗体夹心ABC-ELISA法检测,将抗人胰蛋白酶单抗包被于酶标板上,标准品和样品中的人胰蛋白酶与单抗结合,加入生物素化的抗大鼠人胰蛋白酶,形成免疫复合物连接在板上,辣根过氧化酶标记的Streptavidin与生物素结合,加入酶底物OPD,出现黄色,加终止液硫酸,颜色变深,
8、在450nm处测OD值,人胰蛋白酶浓度与OD值成正比,可通过绘制标准曲线求出标本中人胰蛋白酶浓度。1.5统计学方法计量资料以均数±标准差表示,用SAS6.12统计软件进行分析,数据比较均采用近似F检验(SNK-q),P<0.05具有统计学意义。图1RT-PCR示胰腺及胰
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