大豆农杆菌介导转化rnai花叶病毒蛋白基因研究

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1、大豆农杆菌介导转化RNAi花叶病毒蛋白基因研究第一章文献综述1大豆花叶病毒研究进展大豆是豆科、蝶形花亚科、大豆属的二倍体(2n=40)植物，起源于中国，在我国有5000多年的栽培历史，十八世纪后陆续传入欧洲和美洲，20世纪50年代后在美国、巴西和阿根廷等美洲国家迅速喊起，它们和亚洲的中国、印度一起构成世界五大大豆生产国。在中国，大豆是继水稻、小麦、玉来、棉花之后的第5大作物，是重要的粮食作物、油料作物以及词料作物。大豆在生长发育过程中受到许多病虫害的危害，其中花叶病毒病是危害大豆的主要病害之一。据研

2、究，在美国可以侵染大丑的病毒有110多种，在中国也有50多种，其中主要有大丑花叶病毒(Soybeanmosaicvirus,SMV)、菜豆豆荚斑驳病毒(Beanpodmottlevirus,BPMV)、烟草环斑病毒(Tobaccoringspotvirus,TRSV).花生斑驳病毒(Peanutmottlevirus,PMV)、菜豆黄化花叶病毒(Beanyelloosaicvirus,BYMV)以及黄瓜花叶病毒(Cucumbermosaicvims,CMV)等。而大豆花叶病毒是众多大豆病害中影响最大

3、，地域分布最广的病害之一[1]。大豆花叶病是由大豆花叶病毒(Soybeanmosaicvims,SMV)引起的，1915年，Cliton在美国首次发现了大豆花叶病Gardner和Kendrick于1921年将病原描述为SMV[3]。在中国，对SMV的研究始于1939年[4]。大豆花叶病毒引起了国内外科研人员的高度重视，并对其展开了广泛的研究。2RNA干扰及其抗病毒遗传工程应用研究进展RNA干扰是双链RNA在细胞内特异性地诱导与之同源互补的mRNA降解，使相应基因的表达关闭，从而引发转录后基因沉默（p

4、osttranscriptionalgenesilence,PTGS),在植物中发现dsRNA在胞核内也可介导同源DNA甲基化，进而引起转录水平的基因沉默（Transcriptionalgenesilence,TGS)。RNAi的发现可追溯到1990年，Napoli等向矮牵牛(petunias、中导入与粉红色色素合成有关的查耳酮合酶基因（Chalconesynthase,CHS)以产生颜色更深的紫色矮牵牛花，结果许多花朵的颜色不但没有加深，反而变成白色或花白色，因为导入的基因和其同源的内源基因同时都

5、被抑制，所以被称为共抑制(Co-suppression)现象[67],另外，这种共抑制现象被确认是发生在转录后水平，所以又被称为转录后基因沉默(Post-transcriptionalgenesilencing,PTGS)?1995年，Guo等在利用反义RNA技术研究秀丽隐杆线虫、C.elegans)的基因功能时，发现了反义RNA可以阻遏该基因的表达，但正义链的导入也出现类似的现象[68]。1998年Fire等详细阐明了这种现象是由于在制备正义/反义RNA时混入了少量的dsRNA引起的，转入dsRN

6、A后导致的RNA沉默效率比只转正义或反义RNA高10倍以上，并称这种现象为RNA干扰[69]。第二章To代RNAiCP转基因大豆生根苗的获得1材料和方法与水稻、油菜和棉花相比，大豆是公认的难转化植物之一，转化效率一直很低，难以满足基因工程在大豆上应用的需求，因此，建立一个高效的大豆再生体系并应用于大豆遗传转化具有重要的意义。1988年，Hinchee等首次利用农杆菌介导法将外源基因导入大豆此后，研究者们采用不同的转化方法和受体建立了各种大豆遗传转化体系。大豆的转基因方法主要有基因枪法、农杆菌介导法、

7、电激法、PEG法、显微注射法、超声波辅助农杆菌转化法和花粉管通道法等。其中，基因枪法和农杆菌介导法是大豆常用的转基因方法。大豆遗传转化的受体主要有胚轴、未成熟子叶、子叶节、胚性悬浮培养物(细胞团)、原生质体和子房等。目前以农杆菌介导大豆子叶节转化体系应用最为广泛和成熟。本研究以大豆子叶节作为外植体，建立并优化了农杆菌介导大豆子叶节转化体系，依据本实验室该体系，约80天就可以得到转基因生根苗。2结果与分析2.1农杆菌介导大豆子叶节转化体系的建立大豆虽然是农杆菌的良好寄主，但转化效率较低，转化成功依赖于

8、基因型。本实验室在前期大豆农杆菌介导转化体系优化的基础上，从国内外25个基因型中條选到了适宜转化的受体天隆一号。图2-2为本实验室采用的农杆菌介导转化大豆子叶节转化流程图。选择成熟、健康、饱满的大豆种子经氯气灭菌后（图2-2A),在通风柜中咬过夜去除多余的氯气；播种在发芽培养基中发芽1天（图2-2B)；然后分离子叶节为外植体，采用ODfiso为0.8左右的农杆菌菌液共侵染外植体30min(图2-2C)；之后进行光照共培养3天（图2-2D)；共培养后在芽诱导培养基中诱导