葡萄糖激酶基因启动子－30位点pcr扩增的实验条件研究的论文

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1、葡萄糖激酶基因启动子－30位点PCR扩增的实验条件研究的论文【摘要】为确定pcr(聚合酶链反应)扩增葡萄糖激酶基因启动子区，对影响pcr的实验因素进行了系统研究。研究结果表明：最佳引物浓度为0.3μmol/l；以1u酶量效果最满意；最适dntp浓度为167μmol/l；最适mg2+浓度为1.5mmol/l。以上参数偏离最适条件将会导致实验失败。【关键词】聚合酶链反应基因扩增条件聚合酶链反应（pcr）的开发是用来分析基因失调、恶性疾病和许多感染性疾病。为了避免由于不适合的反应条件导致的错误结果，在一种方法应用于临床常规实验之前要对影

2、响反应结果的因素进行研究。本文就从白细胞中提取的基因组dna作为模板，研究了应用pcr方法扩增葡萄糖激酶基因的最适实验条件，以便进而研究其与2型糖尿病发生的关系。现以正常人的基因为对象，报告如下。1材料和方法1.1材料主要仪器：pe9600基因扩增仪；bio-radpoini-proteinⅱ型电泳槽及geldoc1000紫外图像分析系统；tj－6型低温离心机；430ph计；p10,p100微量加样器。.主要试剂：5od260的寡核苷酸引物；100mmol/l的dntp；低熔点琼脂糖；5u/μl的taq酶。1.2方法模板的准备：本

3、文使用的模板是从人体白细胞中应用酚/氯仿/异戊醇提取的基因组dna[1]。提取的模板用100μlte缓冲液，60℃加热10－15分钟溶解后，-20℃冰冻保存。目的片段的扩增：寡核苷酸引物根据文献报道设计：上游引物为5’-caaggcgattgagtggtcaccatg-3’，下游引物为5’-gactgtgtctctcacatcctagcc-3’，扩增片段长度为258个碱基。反应体系中模板1μl，10×缓冲液3μl，加双蒸水至30μl条件不变，分别变化taq酶、dntp、引物、mg2+的浓度，按94℃预变性5min，后94℃1min

4、，60℃1min，72℃1min进行35个循环，最后72℃延伸5min。用2％琼脂糖凝胶电泳，透射式紫外灯下观察扩增产物片段。2结果2.1pcr实验条件2.1.1通常pcr实验的酶用量范围为0.5u-2u。其他扩增条件不变的情况下设定系列taq酶量0.5～5u之间。结果表明，均可以扩增出目的dna，产物量之间并无差异，但5u时出现非特异性扩增。为了使以后扩增更加有效，选择taq酶量为1u。2.1.2通常引物的浓度常用的范围为0.1-1μmol/l。高浓度的引物可能会引起反应的错配或非特异性产物。其他扩增条件不变的情况下设定系列引物

5、浓度，范围设计在0.1～1μmol/l的浓度之间。结果表明，均有产物扩出，引物二聚体的浓度依次增加，但引物浓度超过0.3μmol/l时产物量接近最高而二聚体的浓度相对低；当到达1μmol/l时二聚体明显过剩，产物量反而降低；选择引物二聚体较少而产物量高时的引物浓度0.3μmol/l为最佳浓度。2.1.3一般反应中每种dntp的最终浓度可为20-200μmol/l。本项实验dntp的浓度设计在20－200μmol/l之间，共6个浓度，其他扩增条件不变的情况下设定系列dntp浓度，范围设计在42-250μmol/l之间。结果表明：产物

6、量随dntp浓度的增加而增加，但在167μmol/l后产物量并无明显增多，选择其最适dntp浓度为167μmol/l。2.1.4绝大多数pcr扩增方案中镁离子浓度在0.5-10mmol/l之间，但各反应有自己的最适酶离子浓度（差异较大）。其他扩增条件不变的情况下镁离子浓度在0.5-5mmol/l之间设定6个梯度。结果表明：0.5mmol/l的mg2+浓度时扩增产物量很低，而1～2mmol/l的浓度产物量均较高，而2mmol/l后随着mg2+浓度的增加产物量有所降低，因此选择其中间值1.5mmol/l为实验中的最佳浓度。3讨论进行p

7、cr扩增所涉及的实验条件很多，结合众多文献以及前期实验基础，并通过预实验，只对扩增时与产物的特异性及产量影响较大的taq酶量、引物浓度、镁离子浓度以及dntp浓度做了研究。taq酶浓度：本实验发现不同来源和不同批次的taq酶因其活性有不同程度的变化，可导致扩增效率发生明显改变。扩增gck基因启动子区长258bp的dna片段效率较高，taq酶的浓度对扩增体系的影响不大，30μl体系中0.5u的taq酶就可以扩出目的dna。而高浓度的taq酶可以产生非特异性扩增。因此，同一研究中最好使用同一批次的taq酶；在能检查到足够扩增产物的情况

8、下尽量用低浓度的酶而增加扩增数量。引物浓度：过低的引物浓度将导致扩增的失败，而过高的引物浓度又会对pcr的扩增起抑制作用，导致错配，产生非特异性产物，同时产生大量的引物二聚体，所以需要实验来确定最佳引物浓度。另外选择适当厂家合成的高质量引物且进行一