尿微量白蛋白半定量胶体金诊断试剂的研制

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1、尿微量白蛋白半定量胶体金诊断试剂的研制尿微量白蛋白半定量胶体金诊断试剂的研制摘要：目的制备尿微量白蛋白半定量胶体金快速检测试剂。方法本试剂的硝酸纤维素反应膜上预先喷涂检测线(人白蛋白,HSA)、比色线(羊抗兔IgG多克隆抗体,GAR)和质控线(GAR)三条线，金标反应膜中预先吸附有胶体金标记的鼠抗HAS单克隆抗体和兔IgG，在检测过程中，比色线(R线)色度相当于样本中含有人白蛋白20mg/L时，检测线(T线)的色度，通过比较检测线和比色线颜色的深度，进而半定量的推断样本中人白蛋白的含量。结果通过对本试剂和贝克曼微白蛋白试剂的同步检测141份样本，

2、依次按照小于20mg/L/20-50mg/L和大于50mg/L三个区间进行统计，本试剂的灵敏度、特异性分别为100%、100%，且本试剂与尿液中常见的血红蛋白、人IgG、胆红素以及常见的化学药物，在测试浓度水平，均没有出现交叉反应。结论本试剂可以用于半定量检测人尿液中微量白蛋白的存在，通过肉眼观察作定性验查，具有快速、简便、价廉、不需特殊仪器等优点，很适合于没有特殊仪器的基层医院使用。关键词：尿微量白蛋白；人血清白蛋白；单克隆抗体；胶体金；硝酸纤维素膜测定尿微量白蛋白的方法很多，如放射免疫法、免疫浊度法、酶免疫法、免疫荧光法等。放射免疫法灵敏度高

3、、特异性强，是测定尿微量白蛋白的经典方法，但由于有放射性污染且试剂保存期短，很难在临床上广泛开展。目前，免疫浊度法是定量测定尿白蛋白的常用方法，但需要昂贵的仪器设备才能进行。因此建立灵敏度好、特异性好、操作简便的尿微量白蛋白胶体金快速检测试剂，满足临床对肾病患者的初筛，同时本试剂可用于高血压和糖尿病患者的疗效监测，及自我检测。1、材料与方法1.1、材料1.1.1、主要生物活性原料1.1.1.1、鼠抗HSA单克隆抗体本公司细胞室提供，编号是RH-13HSA，采用辛酸-硫酸铵沉淀法纯化，用于胶体金的标记。1.1.1.2、兔IgG、羊抗兔IgG多克隆抗

4、体，均由军事医学科学院基础医学研究所提供。1.1.2、主要试剂HSAFractionVHighPurity：Merck公司产品；GoldChloride(HAuC14.3H2O)和BSAFractionV：EMDChemicalInc产品。1.1.3、硝酸纤维微孔滤膜(NC膜)：汕头伊能膜业有限公司产品，孔径为8μm。1.1.4、标准品：人血清白蛋白(HSAFractionVHighPurity)：Merck公司产品，准确稀释，标定，-20备用。1.2、检测试剂1.2.1、金标结合物反应膜1.2.1.1、胶体金溶液在加热煮沸的400ml纯化水中快

5、速加入1%氯金酸溶液8ml，待溶液再次沸腾后，迅速加入2%柠檬酸钠溶液8.8ml，继续煮沸，观察溶液颜色由黄色变灰变黑再变紫，最后变成稳定的酒红色后，计时继续煮沸10min，冷却至室温后，补水至400ml。1.2.1.2、金标结合物的制备鼠抗HAS单克隆抗体的标记：取100毫升胶体金，使用0.2M碳酸钾调整至PH8.0，在磁力搅拌下，一次性加入鼠抗HAS单克隆抗体1毫克，搅拌10分钟后静置10分钟；再加入稳定剂(2%BSA+0.1%PEG20000)，搅拌30分钟；采用12000转离心40分钟，小心吸取上清，沉淀为胶体金-鼠抗HAS单克隆抗体结合

6、物，备用。稀释后测定波长521nm处的OD值，将原胶体金标记物使用金标工作液(0.5M硼酸盐(PH9.0)+2%Tween+5%蔗糖+1%BSA+1%水解酪蛋白+0.1%PVA)稀释至30OD。兔IgG标记：操作步骤同上。取100毫升胶体金，使用0.1M碳酸钾调整至PH7.4，按照每1毫升胶体金对应8μg兔IgG的比例进行标记。经离心后，沉淀为胶体金-兔IgG结合物，稀释至10OD。分别取上述金标工作液，按照每平方厘米10微升的比例涂布无纺布，室温干燥。1.2.2、硝酸纤维素反应膜1.2.2.1、在硝酸纤维素膜上使用BIO-DOT包被机分别喷也制

7、备检测线(T)、比色线(R)和质控线(C)，干燥后以封闭液(0.01M，PH8.0PBS+2%BSA+2%脱脂奶粉)封闭2小时，在用洗涤液(0.01M,PH8.0,PBS+0.05%Tween20)洗涤3次，干燥。其中检测线(T)使用0.05M，PH9.6CB稀释的HSA(0.5mg/ml),比色线(R)和质控线(C)使用0.02MPB+0.2%BSA进行稀释，浓度分别为0.2mg/ml、1.0mg/ml。1.2.3、胶体金试剂条将上述金标反应膜、硝酸纤维素反应膜和其它辅料(吸水纸、玻璃纤维)等依次粘切于白色的塑料基板上，切成3mm试条。1.3、

8、检测方法将有箭头标志线一端插入样本收集容器中，确保样本液面直到标记线且浸没时间应大于10~15秒(注：深度不可超过标志线横线)，然后取出