肝细胞癌组织中skp2的表达及与p27kip1、pcna蛋白表达的关系论文

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1、肝细胞癌组织中Skp2的表达及与p27kip1、PCNA蛋白表达的关系论文程阳，王酉，陈莉，陆牡丹，秦军，崔小鹏，李鹏，刘胜利【摘要】目的：探讨Skp2的表达在肝细胞癌(HCC)发生发展中的作用.freelanhepatocellularcarcinoma(HCC).Methods:ImmunohistochemicalstudyforSkp2，p27,PAedon10casesofnativelivertissueadjacenttohepatichemangiomaandin76casesofhepato

2、cellularcarcinomatissuesandadjacentnontumoroustissues.Freshspecimensfrom10casesofHCCandtheadjacentlivertissuemunohistochemistryof76HCCsshoarkedincreaseinSkp2andPAexpressionsbutnotp27,inHCCparedalpha-fetalproteinlevelsandmetastasis(P0.05).InHCC,inversecorrel

3、ationallivertissues，andoverexpressionofSkp2reducestheproteinlevelofp27throughubiquitin-dependentdegradationandcausesdisruptionofcellcyclecontrolandenhancementoftheproliferativeactivity,indicatingSkp2playesanimportantroleinoncogenesisanddevelopmentofHCC.Keya

4、；Immunoblotting；Immunohistochemistry；Proliferatingcellnuclearantigen；Skp2；P27肿瘤既是一类基因疾病，也是一类细胞周期疾病。几乎所有癌基因的功能效应最终都要汇聚到细胞周期机制上来。细胞S期激酶相关蛋白-2(S-phasekinase-associatedprotein2，Skp2)是SCF泛素连接酶复合体的特异底物识别亚单位F-box蛋白家族的成员之一，能特异性地作用于磷酸化细胞周期负性调控因子p27，使其通过泛素-蛋白酶体途径降解，导

5、致细胞周期调节失控。近年来研究发现，Skp2在多种肿瘤组织中表达均增高，而p27表达减少,从而推断Skp2表达及功能的异常有可能经由细胞周期相关蛋白的泛素化依赖的蛋白水解途径，参与了肿瘤的发生发展1~4。肝癌是全球发病率最高的恶性肿瘤之一，其中约55％发生在中国5，但有关Skp2及p27和PA在肝癌组织中，尤其是新鲜组织中的表达以及与肝癌生物学特征的相关性研究较少。我们用免疫印迹和免疫组化方法检测HCC组织中Skp2、p27和PA三种蛋白的表达，旨在探讨三者的相关性及与临床病理特征的联系。1材料与方法1.1组

6、织标本及病例收集南通大学附属医院肝癌手术切除的10对新鲜HCC组织及对应的癌旁肝组织，用于提取蛋白。收集南通大学附属医院及市医院有病理资料76例HCC石蜡标本用于免疫组化及临床病理统计。其中HCC采用arkers公司）。鼠抗人PA单抗、柠檬酸抗原修复液及DAB显色剂（北京中山生物技术有限公司）。鼠抗人Skp2（zymed公司），HRP标记的山羊抗小鼠IgG、HRP标记的山羊抗兔IgG、β-actin单抗（Sigma公司）。二步法免疫组化检测试剂盒（GBI公司）。1.3方法1.3.1蛋白质免疫印迹检测选择其中6

7、对HCC组织及癌旁组织，匀浆提取组织蛋白。全自动蛋白质核酸定量仪测定蛋白含量，10%SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白，蛋白上样量40μg，转移槽转移到PVDF膜。室温封闭2h。一抗p27kip1(c-19)1∶500,Skp2(H-435)1∶500，PA1∶1000,β-actin1∶30004℃过液，HRP偶联的二抗(1∶1000)室温2h，ECL显色。1.3.2免疫组化染色和判定标准操作步骤按免疫组化试剂盒说明进行。用已知的乳腺癌阳性片作为阳性对照，PBS代替一抗作为阴性对照。DAB显色，苏木素复染，明

8、胶甘油封片。光镜下每张切片选取5个有代表性的高倍视野（400×），每个视野随机计数500个肿瘤细胞，计算阳性细胞百分率。每个指标的染色结果以其标记指数(Labelindex，LI)表示，LI＝阳性细胞数/细胞计数的总数。1.3.3统计学方法显著性差异采用秩变换检验、方差分析，相关性分析采用χ2检验、Fisher精确概率法及Spearman等级相关分析，全部数据采用Stata7.0统计分析系统，P0.