限制热量对nit1细胞胰岛素-胰岛素样生长因子通路及胰岛素分泌功能的影响论文

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　　限制热量对NIT1细胞胰岛素/胰岛素样生长因子通路及胰岛素分泌功能的影响论文朱志宏陈慎仁傅玉才魏炽炬杨杰华林超【摘要】目的研究限制热量(CR)对胰岛素β瘤细胞(NIT1)细胞胰岛素/胰岛素样生长因子(IGF1)信号通路及胰岛素分泌功能的影响，为2型糖尿病（T2DM）的发病机制及防治提供实验依据和理论基础。方法NIT1细胞培养至指数生长期，分别用PI3K的阻断剂LY294002(LY)进行干扰，实验分成4组：对照组；CR组；LY+CR组；LY组。用RTPCR、免疫细胞化学等方法检测Foxo1及其下游基因的转录及表达，用放射免疫及免疫细胞化学法检测胰岛素的分泌及表达，用细胞计数法检测细胞倍增周期。结果①CR可使NIT1细胞倍增周期延长；②Foxo1主要定位于胞浆，阻断PI3K后Foxo1从胞浆移入胞核，mRNA转录减少；③CR在正常状态及PI3K通路障碍的细胞均可使Foxo1mRNA转录增加.freel的转录；④PI3K通路障碍可使NIT1细胞胰岛素分泌增加，CR则可使PI3K通路障碍的NIT1细胞胰岛素分泌减少。结论CR不需通过上游PI3K/Akt，可直接或间接作用于Foxo1参与对胰岛素/IGF1信号通路的调控，延长细胞寿命，增强NIT1细胞的糖耐量，改善胰岛素信号的传导及NIT1的胰岛素分泌功能；可能参与了T2DM的发生发展。【关键词】限制热量；胰岛素/胰岛素样生长因子；Foxo1；胰岛素；2型糖尿病【Abstract】ObjectiveToinvestigatetheeffectsofCalorieRestriction(CR)oninsulin/IGF1signalpathedium,anotherglucoseulatedbyLY294002(LY),theblockingagentofPI3K.SamplesandFasLmunocytochemicalassay.Thesecretionandexpressionofinsulinmunityandimmunocytochemicalassay.Thecellmultiplicationcycleeasuredbycytometry.Results①CRextendedthecellmultiplicationcycle;②Foxo1,itmovedintothenucleusanddiminisheditstranscriptionatterthePI3KpathofPI3K/Akt,CRcoulddirectlyorindirectlyeffecttheactivityofFoxo1,sothattoregulatetheinsulin/IGF1signalpathprovetheconductionofinsulinsignalandthefunctionofinsulinsecretion.Therefore,CRmayparticipateinthegenerationanddevelopmentofT2DM.【Key及FasL等的调控，从而影响β细胞寿命及胰岛素分泌，改善PI3K/Akt功能障碍所致的胰岛素信号传导障碍及IR，参与T2DM的发生发展。本研究在细胞水平观察CR对胰岛素β瘤细胞(NIT 1)细胞寿命、胰岛素的分泌功能及IR等的调控作用，为T2DM的发病机制提供实验依据。1材料与方法1.1实验材料实验细胞：NIT1细胞由美国标准菌库（ATCC）保存，ATCC○R号：CRL2055TM。NIT1细胞系来自NOD/Lt小鼠胰腺胰岛β细胞，是转染了肉瘤病毒40（SV40）后自发的胰岛素瘤细胞，培养基中的葡萄糖可刺激它分泌胰岛素，与胰岛β细胞有非常相似的生理功能。主要试剂：胎牛血清FBS（KPL）、高糖（0.45%葡萄糖）DMEM（Gibco）、无糖DMEM（Gibco）、胰酶+EDTA（Gibco）、兔抗鼠Foxo1抗体（Santacruz）、小鼠抗鼠p27抗体（Sigma）、兔抗鼠Bim抗体（Santacruz）、羊抗鼠FasL抗体（RD）、鸡抗鼠胰岛素抗体（Abcam，ab14042）、辣根过氧化物酶标记（HRP）的山羊抗鸡二抗（KPL）、生物素标记的山羊抗兔IgG抗体（KPL）、兔抗小鼠IgG二抗（Sigma）、兔抗羊二抗（KPL）、ABC试剂盒（VectorLaboratories）、LY294002（LY，Sigma）、胰岛素放射免疫分析药盒（北京北方生物技术研究所）、总RNA提取试剂盒及cDNA第一链合成试剂盒（Tiangen）、PCR试剂盒（Tiangen）、6×DNA加样缓冲液（Tiangen）、DNAMarker(Santacruz）、PCR引物（上海基康）。引物设计见表1。表1各引物设计1.2实验方法1.2.1NIT1细胞培养与分组及细胞倍增周期计算培养基：90%DMEM（高糖/无糖）加10%FBS（含糖4.77mmol/L），5%CO2、37℃培养，细胞收集后液氮保存。用计数板法进行细胞计数制作生长曲线并计算细胞倍增时间。实验分组：对照组：高糖DMEM加10%FBS及相当量二甲亚砜（DMSO）（培养基含糖0.45%）培养细胞；CR组：无糖DMEM加入10%FBS培养细胞（培养基含糖0.0086%）；CR加LY组：用PI3K的阻断剂LY20μmol/L对CR组细胞进行诱导40min；LY组：LY20μmol/L对对照组细胞进行诱导40min。1.2.2免疫细胞化学染色（SABC法）检测Sirt1、Foxo1、p27、Bim及FasL的表达，细胞用4%多聚甲醛固定20min，0.5%TritonX100作用20min，PBS洗3次×5min，2％牛血清白蛋白（BSA）封闭30min，一抗（用PBS稀释）4℃过夜，PBS洗3次×5min，生物素标记的二抗室温60min，PBS洗3次×5min，1∶100稀释ABC试剂室温30min，PBS洗3次×5min，DAB（1∶ 20）显色，苏木素复染，流水冲洗数分钟，1%盐酸酒精分化数秒，梯度酒精脱水，中性树脂封片，显微镜下观察并拍照。胰岛素免疫细胞化学染色用SP法（免去ABC步骤，其他同SABC法）。PBS代替一抗作阴性对照。1.2.3总RNA提取用TIANGEN公司吸附柱型总RNA提取试剂盒提取总RNA，分光光度计测RNA浓度。1.2.4RTPCR用TIANGEN公司cDNA第一链合成试剂盒，20μl反转录合成系统合成cDNA第一链；用Tiangen公司PCR试剂盒25μl反应系统，用cDNA模板进行PCR扩增，PCR程序：94℃3min；94℃30s，58～60℃30s，72℃1min（以上循环n=24～38次）；72℃6min。1.2.5凝胶电泳5μlPCR产物加1μl6×DNA加样缓冲液，60V电泳30min。用凝胶成像系统观察并拍照。1.2.6放射免疫测定用北京北方生物技术研究所生产的胰岛素放射免疫分析药盒，直接测定胰岛素浓度。每个样品细胞接种数目一致，在加入各种诱导药物前更换细胞培养液，更换培养液的时间一致。1.2.7免疫细胞化学图像采集和分析每张细胞玻片上随机取5个视野，其平均灰度值作为该目的蛋白免疫细胞化学染色的灰度值。应用OlympusBX51型显微镜观察并拍照，SimplePCI软件对Foxo1、p27、Bim、FasL及胰岛素染色摄片进行灰度分析，取各区域平均灰度值作为该视野细胞染色灰度值。1.2.8RTPCR图像分析以18SmRNA（18S）作为内参照，用上海天能科技有限公司GIS凝胶图像处理系统测定目的条带平均光密度值，再与18S条带测得的光密度值相比，用算得的比值进行统计分析。1.3统计学处理数据以x±s表示，采用SPSS11.5软件进行校正的配对t检验与成组方差分析。2结果2.1CR对NIT1细胞倍增时间的影响CR组NIT1细胞倍增时间较对照组延迟21.6%(P＜0.05)，见图1。图1两组细胞生长曲线的比较2.2CR及LY对胰岛素/IGF1信号通路中Foxo1表达及细胞定位的影响对照组Foxo1主要表达于胞浆中；用LY诱导10min后可见Foxo1转移至胞核内，且Foxo1在胞核内停留时间至少可维持40min(P＜0.01)；CR组及LY+CR组，与对照组对比均可见Foxo1部分移位进入胞核(P＜0.01，P＜0.05)，见图2，表1；在mRNA水平，与对照组比较，LY10min组及LY40min组Foxo1mRNA转录水平分别下降76.52%及30.11%(P＜0.01），见图3，LY+CR组下降12.65%（P＜0.01），CR组则升高5.14%（P＜0.01），见图4。图2Foxo1免疫细胞化学染色(×1000)表1 各组免疫细胞化学染色灰度值分析比较2.3CR及LY对胰岛素/IGF1信号通路p27、Bim及FasL表达及细胞定位的影响p27及Bim在正常条件下主要表达于胞浆，胞核较少，FasL则表达于胞膜上；与对照组比较，CR组及LY+CR组，p27的胞核阳性率增高(P＜0.01)；Bim的胞浆阳性率变化各组无显著差异；FasL在CR组表达减少(P＜0.01)，见图5，表1；在mRNA水平，与对照组比较，CR组p27转录增加，LY+CR组及LY组则转录减少，且LY+CR组最少(P＜0.01)；Bim1在LY组表达增加，LY+CR组比LY组有所减少(P＜0.05)，CR及LY+CR组则无统计学差异（P＞0.05）；Bim2在CR组表达减少，在LY组表达增加，且LY+CR组比LY组有所减少（P＜0.01）；各组FasL的mRNA转录水平均无统计学差别（P＞0.05），见图6，7。2.4CR及LY对NIT1细胞胰岛素的表达及分泌功能的影响免疫细胞化学染色方法可见胰岛素均在胞浆中表达，与对照组(122.32±1.72)比较，CR组(126.63±2.00)和LY+CR组(126.56±1.65)灰度值表达均减少（均P＜0.01），LY组(124.02±2.48)，无显著差异(P＞0.05)，见图8；放射免疫法检测NIT1细胞在各组药物作用下胰岛素的分泌量，与对照组为(20.1±2.4)mIU/L比较，LY组为(33.7±2.0)mIU/L（P＜0.01），CR组为(16.7±1.6)mIU/L（P＜0.05），CR+LY组为(25.7±3.1)mIU/L（P＜0.05）。3讨论在胰岛素/IGF1信号通路中，胰岛素/IGF1信号作用于相应受体后，可使PI3K磷酸化并激活移入胞核，从而催化蛋白激酶B（PKB或Akt）磷酸化，后者又可催化Foxo家族蛋白磷酸化，使Foxo移出胞核，失去转录活性〔6〕。哺乳动物胰岛β细胞中主要是Foxo1。本研究发现PI3K/Akt通路的中断可使Foxo1转移至胞核内，同时其mRNA转录水平下降，这种mRNA水平的下降可能是由于Foxo1移入胞核后活性增强而抑制Foxo1蛋白表达所致。CR细胞Foxo1mRNA转录明显增加，而PI3K/Akt通路障碍细胞的Foxo1转录水平也增加，同时细胞倍增周期延长，即细胞寿命延长。可见，CR延长寿命可能与Foxo1有关。在胞核内Foxo活化后主要通过死亡受体途径（如FasL）和线粒体途径（如Bcl2家族，包括Bim）而活化caspase凋亡基因，最终通过底物酶切作用导致细胞凋亡。本实验显示，CR在使Foxo1转录增加的同时其下游基因p27转录增加，Bim2则减少，Bim1和FasL无明显变化，在PI3K/Akt通路障碍的细胞，Foxo1向胞核移位可使p27mRNA转录水平下降，凋亡基因BimmRNA转录水平增加，而CR在PI3 K/Akt功能障碍的细胞仍可使Bim的mRNA转录水平下降，对FasL的mRNA转录水平无影响；可见，CR并不是通过胰岛素/IGF1信号通路中Foxo1的上游基因起作用的。已知CR使Sirt1转录水平增加〔7〕，Foxo1是Sirt1的靶基因〔8〕，那么可推断，CR至少有一条通路是通过Sirt1来调节Foxo1的，Sirt1表达增强可通过抑制Foxo1的转录活性〔9〕从而抑制Foxo1的凋亡前靶基因Bim的表达、增加周期蛋白p27的表达，从而延长细胞周期，减少凋亡，这与Bru〔10〕的结论一致。本结果表明，CR组细胞胰岛素分泌量明显减少；LY组，胰岛素的分泌则明显增加，这种增加可能是由于PI3K/Akt通路障碍使胰岛素信号传导障碍而反馈性地刺激胰岛素的分泌所致。胰岛素信号的传导包括两条主要通路：丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路和PI3K通路，胰岛素/IGF1信号通过作用于胰岛素或IGF1R而启动下游PI3K的磷酸化级联反应〔6〕，虽然导致IR的分子机制还不清楚，但很大程度是可归因于胰岛素信号通路的传导障碍，胰岛素受体下游的信号分子如胰岛素受体底物（IRS）和PI3K发生异常，都可促使IR的发生发展〔11〕；在LY+CR组，仍然表现出糖刺激后胰岛素分泌的大幅度上升，但较LY组明显下降，说明CR能明显减少胰岛素的分泌量，改善IR，机制尚需研究。【