cox2和vegf与肝癌多细胞球体群集耐药性的关系的论文

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1、COX2和VEGF与肝癌多细胞球体群集耐药性的关系的论文作者：姚煜，田涛，崔洁，赵娜，郭亚焕，南克俊【摘要】目的：探讨cox2和vegf在肝癌多细胞球体（mcs）中的表达与肝癌群集耐药的关系.方法：以liquidoverlay技术获得肝癌hepg2多细胞球体为模型，采用透射电镜和扫描电镜比较单层细胞与mcs的形态学差异；采用mtt法和流式细胞技术比较adm和5fu对单层细胞和mcs的生长抑制率和细胞凋亡率；采用免疫组化和图像分析技术比较cox2和vegf在单层细胞和多细胞球体表达的差异.结果：与单层细胞相比，多细胞球体细胞间黏附广泛而紧密，可见中间连接和

2、桥粒连接.不同浓度的adm和5fu作用48h，mcs细胞的生长抑制率和细胞凋亡率均低于单层细胞，差异有统计学意义（p<0.05）.免疫组化结果显示，cox2和vegf在mcs上高表达（p<0.05）.结论：肝癌mcs具有群集耐药性，可能与其高表达cox2和vegf有关.【关键词】肝癌；群集耐药；环氧化酶2；血管内皮生长因子0引言肿瘤细胞出现耐药现象是肿瘤化疗失败的主要原因之一.三维细胞培养比平面细胞培养更能反映体内肿瘤的情况［1］.我们检测肝癌多细胞球体（multicellularspheroids，mcs）对阿霉素（adriamycin，a

3、dm）和5氟脲嘧啶（5fluorouracil，5fu）的耐药性以及环氧化酶2（cyclooxygenase2，cox2）和血管内皮生长因子（vascularendothelialgroulticellularresistance，mcr）中的表达的关系，探讨肝癌mcs的耐药机制.1材料和方法1.1材料人肝癌hepg2细胞购自美国atcc，由本室保存；rpmi1640培养液购自gibco公司；噻唑兰（mtt）和二甲基亚砜（dmso）购自sigma公司；annexinvfitc试剂盒购自晶美生物公司；cox2鼠抗人mab和vegf鼠抗人mab购自s

4、antacruz公司.透射电镜（hitachi，h600）；扫描电镜（jeol，jsm840）；高通量多功能微板测试系统（bmg，polarstaroptima）；流式细胞仪（bd，falscalibar）；图像信号采集与分析系统（leica，q550cl在6孔板上铺一薄层，冷却后接种hepg2细胞（1×106/l）2ml，每48h半量换液1次，4d后形成mcs.1.2方法1.2.1细胞超微结构观察取平面细胞和mcs，置于25g/l戊二醛固定液中4℃固定2h，10g/l四氧化锇固定液4℃后固定2h，乙醇梯度脱水，置换，切片，喷金后用透射电镜和扫描电镜观察.1

5、.2.2细胞抑制率的检测将细胞接种于96孔板中，在不同浓度adm和5fu作用48h后，每孔加入5g/lmtt20μl，继续孵育4h后弃上清，每孔加入150μldmso振荡5min，于492nm波长处检测每孔a值，以不加药物组为空白对照，计算细胞抑制率.细胞抑制率（%）=［(1-实验组a值)/对照组a值］×100%.1.2.3细胞凋亡的检测单层细胞和mcs分别经不同浓度adm和5fu作用48h后收集，按照试剂盒说明书加入annexinvfitc和pi，避光染色15min后，上机检测细胞凋亡率.1.2.4检测cox2和vegf的表达单层细胞制作细胞爬片，40

6、g/l多聚甲醛固定20min后备用.mcs40g/l多聚甲醛固定1h后，乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，常规切片后备用.根据试剂盒说明进行免疫组化染色，阴性对照用pbs代替一抗.用leicaq550ccs的形态学特点单层hepg2细胞贴壁生长，细胞表面有较多的微绒毛样突起，细胞间隙较大（图1a），细胞间连接少见，仅见一类似紧密连接样的结构（图1b）.mcs悬浮生长，细胞相互聚集并迅速增殖，形成细胞数目不等的球形多细胞聚集体，具有三维的结构特征，于培养后4d直径达到200μm左右(图1c)，细胞间黏附广泛而紧密，可见桥粒连接和中间连接（图1d）.2.2单层细胞和m

7、cs细胞抑制率的比较mtt实验结果表明，除0.15625mg/l组以外，经0.3125，0.625，1.25和2.5mg/l的adm作用48h后，mcs的细胞抑制率低于单层细胞（p<0.05，图2a）；经6.25，12.5，25，50和100mg/l的5fu作用48h后，mcs的细胞抑制率低于单层细胞（p<0.05，图2b）.2.3单层细胞和mcs细胞凋亡的比较经0.5，1.0，2.0mg/ladm作用48h后，mcs的细胞凋亡率低于单层细胞（p<0.05，图3a）；经40和80mg/l5fu作用48h后，mcs的细胞凋亡率低于单层细胞（p

8、<0.05，图3b