黄芩苷抗呼吸道合胞病毒感染作用的体外研究论文

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时间:2018-07-06

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1、黄芩苷抗呼吸道合胞病毒感染作用的体外研究论文张丽亚董琳陈小芳王平【摘要】目的探讨黄芩苷(baicalin)的体外抗呼吸道合胞病毒(RSV)感染作用及最佳浓度。方法应用微量细胞培养技术,观察RSV感染人喉癌(Hep-2)细胞病变效应(CPE)。观察不同浓度黄芩苷对人肺癌腺上皮(A549)细胞的CPE及RSV感染后CPE的抑制作用。应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测黄芩苷对A549细胞的毒性作用和RSV感染后细胞存活率的影响。结果黄芩苷浓度≤0.156mg/ml时,A549细胞未显示明显CPE,MTT比色法结果与CPE观察结果相符;浓度在0.078~1.25mg/ml时,RSV感染的A

2、549细胞仅出现轻微CPE,0.625mg/ml时对CPE有最好的保护作用;治疗指数(TI)为19.23;MTT比色法也显示以上浓度范围黄芩苷组的细胞存活率明显高于RSV感染组,差异有统计学意义(P均0.05),其中以0.3125mg/ml组的细胞存活率最高.freelg/ml,最佳作用浓度为0.156mg/ml。【关键词】黄芩苷呼吸道合胞病毒抗感染体外实验【Abstract】ObjectivesTosearchtheeffectofbaicalinforinfectionofrespiratorysyncytialvirus(RSV)andthebesteffectiveconcen

3、tration.MethodsMicro-icroscopically.TheCPEofA549cellsinducedbybaicalinofdifferentconcentrationandtheeffectsofbaicalinonchangeofCPEofA549cellsinducedbyRSVinfectionicroscopically,too.Methylthiazolyltetrazolium(MTT)assayalA549cellsandprotectiveeffectsofitonRSVinfectedA549cells.ResultsTT)购自美国Amresco

4、,FBS为四季青公司产品,RPMI-1640培养液和0.25%胰酶均为GIBCO公司产品。细胞生长液为10%FBS的RPMI-1640培养液,内含100U/ml青霉素、100mg/ml链霉素,细胞维持液除FBS含量为2%外,其它成分同细胞生长液。1.2方法(1)人肺癌腺上皮(A549)和Hep-2细胞培养:细胞以1×105/ml浓度接种于25cm2培养瓶中,置于37℃,5%CO2培养箱培养,每隔2d换液,待细胞长至80%融合状态时用于实验。(2)RSV增殖:将冻存的病毒株复苏后接种于对数生长期Hep-2细胞上,于2~5d出现细胞病变,待病变达100%时收获病毒,置-20℃≥2h,37℃

5、反复冻融3次。3000转/min离心10min,弃沉淀,收集病毒上清,即为备用的病毒原液,分装后于-80℃保存。(3)RSV半数感染量(TCID50)的测定:Hep-2细胞以1×105/ml浓度接种96孔培养板,每孔100μl。病毒原液用维持液10倍系列稀释9个浓度。细胞长成单层时吸弃培养液,D-Hanks液洗2次,接种各稀释度的病毒液,每个浓度6个复孔,每孔50μl。并设正常细胞对照组。置33℃、CO2培养箱中吸附2h后吸弃上清液,每孔加维持液100μl,置培养箱中继续培养。逐日观察细胞病变效应(CPE)并记录,连续观察7d,用Reed-Muench公式[7]计算病毒TCID50。本

6、实验采用病毒滴度为TCID50:10-7.7/50μl。(4)黄芩苷对细胞的毒性测定(即药物的无毒限量测定):将成层良好的A549细胞经消化成单个细胞,用生长液调整细胞数至1×105/ml,按0.1ml/孔加入96孔微量细胞培养板中,48h后形成单层细胞备用。用D-Hanks液清洗2次后加入维持液递倍稀释(1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128、1:256)后的黄芩苷,每个浓度6个复孔,每孔100μl,并设正常细胞对照。置37℃、5%CO2培养箱中培养,观察细胞融合、坏死、脱落、漂浮、死亡等CPE,表示为[8]:0%~25%(+),25%~50%(++),50

7、%~75%(+++),75%~100%(++++),采用Reed-Muench法[9]计算CPE不再进展时(约72h)黄芩苷对A549细胞的半数中毒浓度(TD50)。然后每孔加入10μlMTT溶液(5mg/ml),继续培养4h,倒置显微镜下观察MTT结晶状况,然后弃去孔内上清液,每孔内加入150μl二甲基亚砜,低速振荡10min后,在酶联仪A490nm下测定光密度(OD)值,并设630nm为参照波长,取6孔平均值确定药物的最大无毒浓度。此实验重

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