衰老hdf细胞dna损伤与hsp70mrna表达及山茱萸多糖的作用论文

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1、衰老HDF细胞DNA损伤与HSP70mRNA表达及山茱萸多糖的作用论文张慧丹孙洁欧芹葛堂栋【摘要】目的探讨山茱萸多糖(FCP)血清对抗人胚肺二倍体成纤维(HDF)细胞衰老的作用及热休克蛋白(HSP)70的调控机制。方法体外培养HDF细胞。根据HDF细胞代龄和施加因素分为4组，即青年组(32±3代)、多糖组(52±3代用1%多糖含药兔血清处理)、对照组(52±3代用1%正常兔血清处理)和衰老组(52±3代)。自45代开始加含多糖药血清并以空白血清培养作对照。观察细胞形态，MTT检测细胞活力，单细胞凝胶电泳检测DNA损伤，RTPCR检测HSP70mRNA表达。结果与青年组比较，衰老组细

2、胞活力明显下降(P0.01)，DNA损伤率增加(P0.01)，HSP70mRNA表达下降(P0.01);多糖组细胞活力明显增高(P0.01).freelRNA表达增加(P0.01)。结论FCP血清可以通过调节HSP70的表达减轻细胞DNA损伤从而发挥抗HDF细胞衰老的作用。【关键词】FCP;HSP70;DNA损伤;HDF【Abstract】ObjectiveToinvestigatetheantiagingeffectoftheserumechanismofheatshockprotein70onhumandiploidfibroblasts(HDF)agingcell.Metho

3、dsConventionalcultureedintheHDFcells,theserumofFCPandcontrolbloodserumentgroupfrom45generation.Thecellchangesicroscope.Thecellactivityethod.TheDNAdamageethodinetheexpressionofHSP70mRNA.ResultsInaginggroupthecellactivityageRNARNAageechanismofantiagingeffectoftheserumFCPistoregulatetheexpression

4、ofHSP70mRNA,toreducetheDNAdamage.【Keyage;Humandiploidfibroblasts(HDF)热休克蛋白(HSPs)作为“分子伴侣”与细胞的许多重要生理过程相关,在维持细胞正常功能上起关键作用〔1〕，其中HSP70是最受关注、研究最深入的一种。近年研究发现，其与衰老关系密切,通过转染HSP70基因,能够延长果蝇、美丽线虫的寿命〔2，3〕。伴随着机体衰老，HSP70的表达也呈下降趋势〔4，5〕。HSP70不仅是判断细胞生理状态和应激能力的指标,而且也可作为机体或细胞老化的一个重要因素。但衰老条件下HSP70在DNA损伤中的作用目前仍不十分清楚

5、。现代药理学研究表明，山茱萸多糖(FCP)具有抗炎、抗病毒、抗氧化等多种药理活性〔6〕,已成为临床上最常用的名贵中草药之一，深入研究其有效成分，综合开发利用山茱萸，具有重要的社会效益和经济价值。本实验通过检测FCP血清对HDF细胞HSP70基因表达诱导作用的调控及DNA损伤情况,进一步探讨FCP抗衰老作用机制及HSP70在DNA损伤的作用，以明确HSP70与衰老的DNA损伤之间的关系。1材料与方法1.1药物与试剂HDF细胞系南京凯基生物公司提供，小牛血清、胰蛋白酶、MTT粉、DMSO由北京华美公司提供。DMEM培养基为美国Invitrogen公司产品。DEPC处理水、Trizol为上

6、海生工公司产品。单细胞凝胶电泳试剂盒为南宁高新生物公司产品，RTPCR试剂盒为TaKaRa公司提供。1.2实验分组和处理20代HDF细胞用含10%小牛血清的DMEM培养液培养,至45代始加含FCP兔血清，并以正常兔血清作对照。小于35代为年轻细胞，大于55代为衰老细胞。根据HDF细胞代龄和施加因素将细胞分为4组：即青年组(32±3代)、多糖组(52±3代，用1%多糖含药兔血清处理)、对照组(52±3代，用1%正常兔血清处理)和衰老组(52±3代)。1.3指标检测1.3.1细胞形态和活力检测细胞传代前在显微镜下观察细胞的生长状态和一般情况，并拍照。采用MTT法检测细胞活力，酶联免疫仪

7、490nm波长测定各孔光吸收值，记录结果。1.3.2DNA损伤检测用单细胞凝胶电泳(SCGE)检测细胞的DNA损伤程度，515～560nm(绿光)波长激发光，观察核DNA和迁移DNA(彗星尾)。每张随机选择200个细胞，计算DNA损伤率。1.3.3RTPCR检测HSP70mRNA表达Trizol常规提取细胞总RNA,.freelanDU800)检测，A260/280比值为1.8～2.0。取1μg总RNA按以下条件进行逆转录：45℃，30min;99℃，