灵芝多糖抗h2o2诱导的hdf细胞衰老及其机制的研究

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1、灵芝多糖抗H2O2诱导的HDF细胞衰老及其机制的研究作者：魏晓东邓连瑞张惠丹欧芹【摘要】目的探讨不同剂量灵芝多糖（GLP）对抗H2O2诱导的HDF细胞衰老及可能的细胞周期调控机制。方法将HDF细胞培养至24代时分成6组：即青年组、对照组、衰老模型组及GLP小剂量（50mg/L）、中剂量(100mg/L)、大剂量(150mg/L)组,体外DMEM培养,各GLP组和衰老模型组自30代始添加H2O2诱导HDF细胞衰老，直至38代。采用MTT法检测细胞活力；Dimri法检测β半乳糖苷酶活性；RTPCR法检测p16INK4a、CyclinD1、CDK4的表达；EM高糖培养基，

2、在饱和湿度、37℃、5%CO2条件下培养HDF细胞，GLP50、100、150mg/L组于第24代始，加入相应终浓度的GLP，至30代。30代为年轻细胞，衰老模型组及GLP各组在30代细胞长至60%～70%时，倒掉培养液，加入含50μmol/LH2O2的PBS，37℃、5%CO2孵育30min,倒掉含H2O2的PBS液，以PBS洗两遍，加入含10%胎牛血清的DMEM高糖培养液，每隔两代重复作用1次，共作用4次（同期对照组收获为38代细胞）。1.2.2指标测定MTT法检测细胞活力，Dimri〔3〕法检测细胞内β半乳糖苷酶活性，RTPCR法检测p16、CyclinD1、

3、CDK4mRNA的表达，PCR产物进行灰度分析。采用V2.0软件分析，以每条蛋白电泳带的灰度值定量分析。1.3统计学处理实验数据均以x±s表示，采用SPSS13.0软件包进行方差分析，组间比较采用t检验。2结果2.1H2O2对HDF细胞形态的改变及GLP的作用见图1。青年组细胞生长良好，呈长棱形，无角质形成。而衰老模型组细胞排列不规则，体积较大，胞内颗粒增多，出现空泡。GLP作用组细胞内空泡减少，衰老表型不明显。2.2H2O2对细胞活力和β半乳糖苷酶活性的影响及GLP的作用见表1。与青年组和对照组比较，衰老模型组细胞活力显著降低（P＜0.01）,β半乳糖苷酶染色阳性

4、细胞数增多(P＜0.01),不同剂量GLP均可明显降低H2O2诱导的β半乳糖苷酶增加(P＜0.01)；GLP各组细胞活力显著高于衰老模型组（P＜0.05，P＜0.01）。表1H2O2对细胞活力和β半乳糖苷酶活性的影响及灵芝多糖的作用2.3H2O2对HDFCyclinD1、CDK4和p16INK4amRNA表达的影响及GLP的作用见图2，表2。衰老模型组CyclinD1和p16INK4amRNA表达明显高于青年组和对照组(P＜0.01)，而CDK4mRNA表达明显减低(P＜0.01)；GLP各组CyclinD1mRNA表达均显著低于衰老模型组(P＜0.01)；而GLP

5、50mg/L组CDK4mRNA表达无明显变化，GLP100mg/L和150mg/L组则显著高于衰老模型组(P＜0.01)，且明显高于50mg/L组（P＜0.05，P＜0.01）。GLP50、100和150mg/L组p16INK4amRNA表达显著低于衰老模型组(P＜0.01)。2.4H2O2对HDF细胞Rb、pRb蛋白表达的影响及GLP的作用见图3。衰老模型组pRb明显少于青年组和对照组(P＜0.01)；100mg/L和150mg/L组pRb较衰老模型组明显增多(P＜0.01),GLP100mg/L和150mg/L组之间无明显差别，但仍明显低于青年组细胞(P＜0.01)

6、；GLP50mg/L组pRb与衰老模型组无明显差异。3讨论研究发现，来源于年轻人的HDF细胞较老年人具有较高的总分裂能力〔4〕，体外细胞的衰老与体内组织的衰老有相关性〔5〕。因此，研究HDF老化可揭示机体衰老过程中所发生的一些变化以及部分机制。本研究结果证实H2O2可明显诱导HDF细胞发生拟衰老改变，出现生长抑制、增殖程度下降，β半乳糖苷酶活性增加。研究结果还说明H2O2诱导HDF细胞CyclinD1mRNA表达升高，CDK4mRNA表达下降，p16INK4a表达升高,Rb磷酸化减少。由此推测H2O2可通过增加p16INK4a量的积累而增强其与CDK4结合的能力，进而

7、阻止CDK4与CyclinD1形成复合物，抑制CDK4/CyclinD1复合物活性，使细胞阻滞在G1期，由此导致细胞生长阻滞于G1期。而H2O2诱导CyclinD1mRNA表达增加和CDK4mRNA表达下降的结果说明，H2O2可通过这种改变加强了阻止CDK4与CyclinD1形成复合物的能力。同时，CDK4水平下降、p16INK4a累积抑制CDK4活性，阻断了转录抑制因子Rb的磷酸化，导致与Rb结合的转录活化因子E2F不能释放，使细胞循环至S期所必需的许多重要基因不能激活〔6，7〕，从而诱发细胞衰老的特征性改变。研究表明GLP可防御H2O