石蜡包埋人体组织str检验的探讨

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1、石蜡包埋人体组织STR检验的探讨【摘要l目的探讨普通甲醛对人体组织dna的影响及提高str检出率的手段。方法取少量石蜡包埋组织，65℃水浴脱蜡，chelex一100法提取dna，pcr扩增，循环次数分别为28次和28+6次，扩增产物经310型测序检测。结果普通甲醛固定5d以内的组织基本上可检出amel及15个str基因座。固定时间延长，检出率下降；pcr循环次数增加，灵敏度增加，但有错误分型的情况。结论普通甲醛固定时问长短直接影响pcr—str的检验。减少模板量有利于pcr反应成功，pcr次数为

2、28+6时，灵敏度增加，但应谨慎判读结果，以免错误分型。【关键词】石蜡包埋组织；dna提取；str【中图分类号】d919．2【文献标识码】b【】1007—9297(2006)01—0050—03在某些民事案件中。成功对石蜡包埋组织进行pcr—str分型来判断其归属问题。对案件的解决起到重要作用。目前国内医院及科研机构大多使用普通10％甲醛固定人体组织。普通10％甲醛固定石蜡包埋的组织中dna降解相对严重，提取高质量的dna并进行pcr—str分型较为困难。实践中人体组织固定时间长短不一，但以1周

3、左右多见。本文的目的是探索普通10％甲醛固定时间对pcr—str分型的影响以及提高检出率的适当方法。材料与方法一、材料石蜡包埋人体组织均取自本所病理室。5个无关个体的心、肾组织用1o％普通甲醛固定5d、8d、12d和15d以上时．剪取组织边缘甲醛完全浸润处。石蜡包埋，常规切片he染色，显微镜下观察确保组织结构清晰，无自溶、坏死和大片出血后，作为本研究材料使用。二、方法1．预处理。切取8ixm厚的石蜡包埋组织，尽量剔除石蜡部分，放入0．5ml离心管中；或挖取小米粒大的石蜡包埋组织，放入0．5ml离

4、心管中。加入500ddin脱蜡，弃除液体。【】2．dna的提取。向每个离心管中加入150ixl的5％chelex一100和8lpk(20mg／m1)，56c【=保温过夜，次日再加4lpk(20mg／m1)，再消化4h，振荡后，100cc8rain，13000rpm／min离心3rain，4oc备用。3．pcr扩增。采用identifiler荧光复合扩增。采用10l反应体系，热循环条件：95c【=预变性l1rain；94oc1rain，59oclmin，72℃lmin，循环次数分别为28次，28+

5、6次(循环28次后，每反应管加0．3ixlamplitaqgolddna聚合酶，再循环6次)；[2】最后60℃延伸45raino4．上样检测。取1．5ldnapcr产物与l2l甲酰胺(formamide)、0．4ixl内标(liz)混合后，经过abi310dna自动测序仪电泳荧光检测，使用genescan(3．1．2)和genotyper软件分析得出基因分型结果。结果1．经普通甲醛固定5d、石蜡包埋的心和肾组织基本上能检出完整的str等位基因型。而随着固定时间的延长，能检出的str基因座数目逐渐

6、减少．出现了大片段等位基因缺失、等位基因扩增不平衡的现象(见图1。2)。本次试验中观测到最短固定时间为8d的组织，因大片段等位基因缺失而造成假纯合子的错误分型(见图3)。而固定时间超过15d时。则最多只能检出性别及个别小片段str基因型，常伴有分型错误。2．当pcr循环数从28次增加到28+6次(先循环28次再加酶循环6次)时，可以检出以前信号弱、无法判读的峰，提高了检出率(见图4)。循环次数的增加，dna检测灵敏度有所提高。但随着固定时间的延长，dna降解严重，增加扩增循环次数．易引起部分st

7、r基因座的分型错误．如图5中d3s1358基因座出现的pull—up峰。讨论【简介】~gg(19~．fs4tblue'4-ed-xln-28+694mple1●⋯-284．6．fs4’gre4,n14-113d-xks-28．i．6s4~npbl●⋯q}●+‘1—i~xir,-2sl+6图4提取普通甲醛固定8天心肌dna，pcr循环数为28次(左图)及28+6次(右图)的检测结果8mlnpk,9,-．．'摹i抽'2yeller9-xin-t5dsmiple~,．

8、．2e+6．fsai3自h9．-xi~l5d跏smtple~'’●‘一fni5v●l●_9-xks-i5d；~'6sink9=2．6．fl蚺l善r．d9．-xi~lsd柳6图5提取普通甲醛固定15天心肌dna。pcr循环数为28次(左图)及28+6次l右图)的检测结果【摘要l目的探讨普通甲醛对人体组织dn的影响及提高sr检出率的手段。方法取少量石蜡包埋组织，65℃水浴脱蜡，chl一100法提取dn，pcr扩增，循环次数分别为28次和28+6次，扩增产物经310型测序检测。结果普通甲醛固定5d以内