沙冬青抗旱诱导基因之选取及amcasp基因之初步分析

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1、沙冬青抗旱诱导基因之选取及AmCASP基因之初步分析第一章绪论1.1植物的干旱胁迫据统计在世界范围内，由于水分胁迫造成的农作物减产可超过其他逆境因素造成减产的总和。植物的抗旱机理十分复杂，对植物抗旱机理的研究抗旱基因的筛选是分子生物学研究的热点之一。近年来，植物抗旱性研究已取得突破性进展，植物形态解剖和生理生化特性的认定、干旱胁迫的信号传递机制、抗旱基因的筛选与功能鉴定等都取得一定的成果，但从根本上解决植物抗旱性提高的命题一直未得到有效解决。植物的抗旱性是一种复合遗传性状，受形态特征、生理生化特性等综合因素控制。在遭受干旱胁迫时，植物会发生

2、一系列变化这些变化包括生理、形态、生化以及分子结构等方面。因此，传统抗旱研究中采用的单一抗旱性指标的鉴定难以充分反映出植物对干旱适应的综合能力，只有采用多项指标的综合评价，才能较准确的反映植物的真实抗旱水平。目前，植物抗旱分子水平的的研究主要集中于渗透调节、作用蛋白类及转录因子三方面基因的筛选与鉴定。三方面相关基因的功能鉴定和基因转化均已有报道，异源表达分析表明目的基因的转化能显著提高受体的抗旱耐盐能力，有效验证了目的基因与植物抗旱性的相关性。1.2干旱胁迫对植物的伤害干旱是影响植物正常生长发育的重要的逆境因子之一，能影响植物生理、形态、生

3、化和分子结构等方面的一系列变化进而影响植物生长、发育及产量(YC、MYB和NAC类转录因子还与植物的生物胁迫相关。由此可见植物的逆境胁迫是一个相互关联的网络系统。第二章沙冬青逆境转录表达谱干旱相关基因的鉴定限制片段长度多态性(AmplifiedFragmentLengthPolymorphism,AFLP)是一种DNA分子标记技术，能根据不同品种(或个体)基因组间的限制性内切酶的酶切位点碱基变化，用于基因组遗传图谱构建、基因定位以及生物进化和分类的研究。cDNA-AFLP是以mRNA反转录形成的cDNA为模板进行AFLP分析的一种技术。cD

4、NA-AFLP除保留了AFLP技术多态性丰富、稳定性高和无需了解基因组序列信息等的优点外，同时还可以集中显示基因表达序列的多态性差异，并且具有重复性好、准确可靠、效率高等特点。逆境转录表达谱是利用限制性内切酶处理不同条件下沙冬青cDNA并利用聚丙烯酰胺琼脂糖凝胶电泳分离差异表达片段而建立的基因筛选体系。沙冬青cDNA-AFLP是以正常生长的沙冬青为对照，对获得的双链cDNA用限制性DNA内切酶MseI和PstI进行酶切。采用mRNA差异显示技术(DDRT-PCR)对酶切产物进行特异性扩增，并利用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)能分辨单碱基数目

5、差异的特点分析实验组获得的cDNA与对照组的差异，获得与逆境处理相关基因的差异表达片段（TDFs）。通过该方法本实验室已获得563条不同逆境（高温、干旱、低温）处理下转录衍生片段（TDFs）。依次命名并进行了差异表达和初步的生物信息学分析。从而获得沙冬青逆境处理差异表达相关基因，为下一步功能相关基因的筛选、鉴定和功能分析提供候选基因。沙冬青逆境转录表达谱能显示逆境处理条件下差异表达片段，但由于cDNA-AFLP技术上的自身原因往往存在假阳性。本研究中为保证所研究基因的干旱诱导表达以建立的逆境转录表达谱为基础通过半定量RT-PCR检验目的条带

6、的差异表达，为下一步基因的筛选提供奠定基础。第三章干旱诱导表达基因的克隆......................34-473.2试验材料.....................34-363.2.1酶及试剂盒.....................343.2.2引物与测序.....................34-363.3试验方法.....................36-413.4试验结果.....................41-453.5讨论.....................45-47第四章AmCASP基因

7、启动子克隆.....................47-554.1试验材料.....................47-484.1.1DNA提取缓冲液.....................474.1.2酶及其他试剂.....................474.1.3引物与测序.....................47-484.2试验方法.....................48-504.3试验结果.....................50-544.4讨论.....................54-55第五章沙冬青

8、AmCASP基因的亚细胞定位.....................55-615.1试验材料.....................555.1.1植物表达载体........