骨组织形态计量学在骨折愈合实验研究中的应用

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1、骨组织形态计量学在骨折愈合实验研究中的应用摘要：骨组织形态计量学是对骨组织进行定量描述的一门技术。目前用于骨质疏松的研究较多，但用于骨折愈合的研究不多。回顾了该方法在骨折愈合实验研究中的主要技术步骤及我们的经验，并对相关参数做了详细描述。关键词：骨组织形态计量学；骨折愈合；实验研究1引言骨组织形态计量学（Bonehistomorphometry），是对骨组织进行定量描述的一门技术，目前主要通过对显微镜下骨组织二维平面的测量，根据体视学原理，推测或转换获得三维参数〔1〕。其基本原理为Cavalieri原理和Delesse原理。Cavalieri原理由17世纪意大利数学家Ca

2、valieri提出，其含义是将物体等距做数个切面，各切面的面积之和（∑a）与切面之间距离（d）的乘积，即可求得物体的绝对体积，用公式表示为：V=∑a・d。Delesse原理由19世纪法国地质学家Delesse提出，是最基本、最简单、最实用的原理之一，用它可求得面积分数（面积密度AA）和体积分数（体积密度VV），用公式表示为：AA=∑A/∑AO=VV（∑A为切面内特征物面积之和，∑AO为切面内参照面积之和）。体视学在材料学、地质学中开展较早，称“定量金相”。1968年，国际体视学会成立，开始并迅速普遍用于生物医学领域。通过1973年3月（加拿大）、1976年3月（法国）、1

3、980年3月（美国）3次骨组织测量学国际学术会的召开，为该方法在骨科领域的应用打下了基础〔2〕。1988年，中国体视学学会和中国生物医学体视学会正式成立，体视学的方法开始在国内得到推广和应用。因此，骨组织计量学用于骨科在国内仅10余年时间。目前应用最多的是用于骨质疏松的研究，而在骨折愈合中则较少，二者尽管有许多相同的地方，却也存在明显不同，对此尚需进一步探讨。2主要技术步骤根据我们的经验，其主要技术步骤为标本制备→采图→测量→转换为参数→结论。2．1标本制备实验动物选家兔比大鼠好，因其更易制作硬切片。涉及到四环素标记、取材、固定、脱水、包埋、制片、染色等步骤。2.1.1四

4、环素标记若要获得动态参数，需对动物行四环素族药物活体标记，如四环素、土霉素、金霉素口服或肌注均可，目的是了解骨矿化动态过程。进行双标时为获得可靠标记结果，每次标记最好连续2天，末次标记在取材前2～3天，2次标记间隔时间兔以6天为最佳。如第4、5天行第一次标记，则第11、12天行第二次标记。2.1.2取材一般在兔桡骨中段造成3mm宽缺损后，以该处为中心共取2cm长桡骨标本。动作要轻柔，以防再次骨折影响结果的准确性。2.1.3固定一般采用10%的福尔马林缓冲液（pH7.0～7.1）或70%乙醇或100%乙醇固定3天。对于四环素标记的标本以乙醇固定为好，福尔马林溶液可使标记的颜

5、色减退。2.1.4脱水用酒精从低浓度到高浓度梯度脱水，若采用80%的固定浓度则勿需脱水。2.1.5包埋包埋剂一般用甲基丙烯酸甲酯和邻苯二甲酸二丁酯，临用时以3∶1比例混合，加过氧化苯甲酯适量，可起催化作用。包埋过程中注意负压抽气，防止气泡形成。2.1.6制片传统对骨组织形态结构的观察，一般多用硬骨磨片和脱钙后切片。这些方法各有其不如人意之处，如：硬骨磨片易破裂、不完整；脱钙后切片易变形、失真，使骨组织很重要的成分矿物质丢失。目前，在骨组织的形态计量学研究中，学者们都认为采用锯片后磨片和不脱钙切片较为理想〔3〕。但我们认为，锯片后磨片费时、费力，过程复杂，一般研究人员难以掌

6、握，其片子厚度也较厚，约为20～30μm，由于投影过多、投影过少、截尾效应将影响部分数据的观察；而采用JungK、LEICASM等重型切骨机行不脱钙切片，根据需要，可准确获得不同厚度的切片（5～10μm），简捷、省时、准确。2.1.7染色染色方法需根据测量目的而选择，如Toluidineblue（甲苯胺蓝），可清晰地显示矿化骨小梁、类骨质、成骨细胞、破骨细胞；Masson染色可清晰区分类骨质、矿化骨小梁，但不易区分细胞；H．E染色可区分细胞，但不如甲苯胺蓝清晰。其他〔4〕尚有VonKossa氏法、SolochromeCyaninR、Goldnen’sTrichrome等，

7、还有像改良的Giemsa、PAS、AB-PAS等。每一种染色方法，无论单一的还是复合的，都使各种组织成分有特定的着色，以便于镜下精确地辨认。2．2采图现在一般都采用一套将显微摄像与计算机相连的特殊图像采集系统（如NikonSpot图像采集系统）采图。采图需注意样本的代表性与可比性。应遵循等距随机抽样的原则；同一标本的照片或视场数的增加并不代表实际研究例数的增加；不同标本的采图部位应基本一致，如均在外骨痂或内骨痂，以使其具有可比性。采图的同时最好用标尺定好标。2．3测量切片制成后就可以进行测量，目前较常用的测量方法有3种〔2〕，