实验八硝酸还原酶活性测定

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1、实验八硝酸还原酶活性测定一、目的硝酸还原酶是植物氮素代谢中的关键酶之一，它与作物吸收利用氮肥有关，对作物的产量和品质有影响。因而可以把硝酸还原酶的活力当作植物营养或农田施肥的指标之一，也可作为品种选育的指标之一。通过本实验可初步掌握测定硝酸还原酶活性的原理与方法。二、原理硝酸还原酶能将NO3－还原成NO2－产生的NO2－的量与硝酸还原酶的活性相关。通过测定反应液中产生的NO2－含量，即可确定酶活性大小。NO2－含量可用磺胺显色法测定。NO2－与磺胺及a－萘胺在酸性条件下生成红色偶氮化合物其反应如下：酶活性可用单位鲜重组织在单位时间内产

2、生的亚硝酸量来表示：亚硝酸态氮微克数/克鲜重组织1小时。三、实验材料、仪器和试剂1．实验材料植物的根、茎、叶，本实验选用白萝卜叶片2．仪器（1）分光光度计（2）离心机（3）真空泵和真空干燥器（4）恒温水浴锅（5）恒温箱（6）刻度吸管（lml、2ml、5ml）（7）试管（8）天平（9）三角瓶（50ml）3．试剂（1）亚硝酸钠标准液：称取0.1000g亚硝酸钠（AR），用蒸馏水溶解并定容至100ml。然后吸取5ml再用蒸馏水定客至1000m1。即为浓度5μg／ml的亚硝酸钠标准液。（2）0.lmol·L－1pH7.5磷酸缓冲液（3）0.2

3、mol·L－1的硝酸钾溶液（4）1％对氨基苯磺磷酸（5）2％α－萘胺（6）30％三氯乙酸四、操作步骤1．标准曲线的制作取6支试管，编号，按下表操作操作项目管号123456NaNO2淀标准液(ml)00.40.81.21.62.0蒸馏水(ml)2.01.61.20.80.40NaNO2含量（μg）0246810磺胺(ml)各4α－萘胺各4摇匀在30℃水浴中保温20分钟。然后在520ml波长下比色测定消光值。以亚硝酸钠含量为横坐标，消光值为纵坐标绘制标准曲线。2．酶反应和酶活性测定将白萝卜叶片洗静，剪成0.5cm2h的小片，混匀后称三份，

4、每份0.5－1.0g，分另放人50ml的三角瓶中，编号按下表加试剂摇匀，置真空于燥器中，抽气10分钟。然后将三角瓶放人恒温箱，在30℃暗条件下保温30分钟。取出后向2，3号瓶中分别加人lml30％三氯乙酸终止反应，将反应液离心（3000rmp10分钟）或过滤。分另吸取2ml反应液于三只试管中各加4ml1％磺胺和0.2％a－萘胺。摇匀在30℃水浴中保温20分钟。然后在520ml波长下比色测定消光值。五、结果与计算酶活性（亚硝酸钠μg／g鲜重·h）＝亚硝酸钠微克数（μg）×稀释倍数／样品重（g）×时间（h）六、注意事项1．酶促反应在暗条件

5、下进行，以防光照下叶绿体形成还原型铁氧还蛋白，促使亚硝酸还原酶把NO2还原成NH3。2．田间采样应在早晨9点以后，光合作用进行了一段时间再进行。