聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析过氧化物酶同工酶

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1、班级：植物118姓名：凌云学号：1101080807聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析过氧化物酶同工酶2012.12.11研究背景：同工酶是指能催化同一种化学反应，但其酶蛋白本身的分子结构组成却有所不同的一组酶。它们是DNA编码的遗传信息表达的结果。最近的研究表明，同工酶与生物的遗传、生长发、代谢调节及抗性等都有一定的关系。因此，测定同工酶在理论上和实践上都有重要的意义。用聚丙烯酰胺凝胶电泳测定同工酶，方法简便、灵敏度高，重现性强，测定结果便于观察、记录和保存。过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶

2、。它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有关系。在植物生长发育过程中它的活性不断发生变化。因此，测定这种酶的活性或其同工酶的变化情况，可以反映某一时期植物体内代谢的变化。实验原理：电泳现象：带电颗粒在电场作用下向着与其电性相反的电极移动，称为电泳(简称EP)。本实验采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳技术，分离小麦幼苗过氧化物酶同工酶，根据酶的生物化学反映，通过染色方法显示出酶的不同区带，以鉴定小麦幼苗过氧化物酶同工酶。影响电泳的主要因素：若将带静电荷q的粒子放入电场，则该粒子所收到的引力F引可用数学式表示如

3、下：F引=E·q（1）式中E为电场强度，单位为“伏特/厘米”，表示电场中单位距离上的电位差。如果这种情况发生在真空中，则带电粒子会朝着电极加速前进并且最后与电极相撞。但在溶液中，由于电场的牵引力F引与加速运动的粒子和溶液之间产生的阻力F引相对抗，故上述现象不会发生。根据Stokes公式，阻力的大小取决于粒子的大小和形状以及所在介质的粘度：F阻=6πγηv（2）式中F阻是球形粒子所受的阻力，γ是球形粒子的半径，η是溶液的浓度，v是粒子移动的速度。在溶液中，由电场而产生的加速力被阻力所对抗，因此：E·q=6

4、πγηv（3）整理可得：v=E·q6πγμ（4）由此可以看出，粒子移动速度（v）与电场强度（E）和粒子所带电荷量（q）成正比，而与粒子的大小（γ）和溶液的粘度（η）成反比。不难想象，非球形粒子（如DNA）在电泳过程中会受到更大的阻力，即粒子的移动速度还与粒子的形状有关。由于带电粒子的泳动速度受场强影响，使得同一带电粒子在不同电场里泳动速度不同。为了便于分析比较，常用迁移率（泳动度）代替泳动速度表示粒子的泳动情况，迁移率（泳动度）的定义是：带电粒子在单位电场强度下的泳动速度，若以m表示迁移率，则：m=v/

5、E（5）将（4）代入（5）式得：m=q/6πγη（6）由上式可看出，迁移率（泳动度）m仅与带电粒子所带电荷的数量、粒子大小及形状和溶液度有关，而与电场强度无关了。由于氨基酸、蛋白质、酶等的电离度α随溶液pH变化而变化，所以在实际电泳中，我们常使用有效迁移率这个概念，有效迁移率（μ）定义为迁移率（m）和当时条件下电离度α的乘积。即：μ=m·α（7）将（6）代入（7）式：μ=q·α/6πγη（8）由（8）式可看出，凡能影响溶液粘度η的因素如温度，影响分子带电量q及电离度α的因素如pH值的改变，均会对有效迁移

6、率产生影响。因此，电泳尽可能在恒温条件下进行，并选用一定pH的缓冲液。同时，所选用的pH以能扩大各种被分离物质所带电荷量的差异为好。这样，在外部条件基本稳定的情况下，各种成分将按其自身特有的性质在电泳中得到很好的分离。以上讨论的基本上是在溶液中进行的自由电泳的情况。而在实际应用中，为了便于分析、鉴定、保存结果或制备的需要，我们往往使用适宜的载体。电泳时应避免选用高电渗物质作支持介质。适宜的支持介质是电泳技术成败的关键。最后要考虑选用离子强度适宜的溶液，一般最适的离子强度在0.02-0.2之间。在稀溶液中

7、，离子强度I可用下式计算：I=0.5∑MiZi²（9）式中：Mi为离子的克分子浓度，Zi为离子的价数。聚丙烯酰胺凝胶的形成与特点：这种凝胶是由丙烯酰胺单体和交联剂N,N'-甲叉双丙烯酰胺，在催化剂的作用下聚合而成的。Acr和Bis在它们单独存在或混合在一起时是稳定的，且具有神经毒性，操作时应避免接触皮肤，但在具有自由基团体系时，它们就聚合，引发产生自由基团的方法有两种，即化学法和光化学法。化学聚合的引发剂是过硫酸铵，催化剂是N,N,N'N'-四甲基乙胺（TEMED）。在催化剂TEMED作用下，由过硫酸铵

8、（Ap）形成氧的自由基，从而引起聚合作用。TEMED在低pH时失效，会使聚合作用延迟，冷却也可使聚合速度变慢。一些金属抑制聚合，分子氧阻止链的延长，妨碍聚合作用，这些因素在实际操作时应予以控制。光聚合以光敏感物核黄素作为催化，痕量氧存在下，不太稳定，所以用它制备大孔痕的浓缩胶较为合适，采用化学聚合形成的凝胶孔径较小，而且重复性好，常用来制备分离胶。聚丙烯酰胺的基本结构，为丙烯酰胺单位构成的长链，链与链之间通过甲叉桥联在一起。链的纵横交错，形