基因诊断在传染病领域中的研究进展

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1、基因诊断在传染病领域中的研究进展陈智浙江大学医学院附属第一医院美国《自然遗传学》杂志200年9月27日发表一项调查报告，列出了未来5至10年内最有希望为改善世界各国、特别是广大发展中国家人们的健康状况作出贡献的十大关键生物技术。这项调查综合了全球28位知名专家的看法，其中包括中国科学院基因组信息学中心暨北京华大基因研究中心杨焕明教授。报告执笔人之一、加拿大多伦多大学生物伦理学联合中心主任彼得辛格博士在接受新华社记者电话采访时说，这项为期5个月的调查由该中心具体负责组织实施，调查中采用了“德尔菲法”，通过反复征求专家的意见，最后根据在健康领

2、域的重要性，为各项生物技术排出了优先次序。其中，位居第一的是针对传染病的分子诊断技术。在发展中国家，近一半的死亡病例由传染病所致，发展中国家现有的很多诊断技术存在着操作不便、费用高昂等缺陷，聚合酶链式反应、单克隆抗体等分子诊断技术如能得到更广泛的使用，进一步降低成本，将可以提高发展中国家传染病诊断的水平，使死亡率降低。排列第二至第十位的生物技术分别为：利用基因工程手段开发重组疫苗的技术；除注射之外，更有效的药物和疫苗输送技术；利用微生物和植物等检测或清除污染的环保生物技术；病原体基因组测序技术；使妇女能有效防御性传播疾病的新技术；可用于识

3、别药物靶标等的生物信息技术；营养价值更高、可对付营养不良的转基因作物技术；可降低激素、干扰素等治疗性蛋白质成本的转基因等技术；可有效促进新药研制开发的组合化学技术。2000年6月26日人类基因组草图的公布，标志着现代医学的发展已逐步进入“基因组医学”的时代。分子医学诊断技术的运用，将是二十一世纪人类医疗保健的重大进展。基因诊断虽然只有短短的20多年历史，但发展迅速，尤其是DNA测序、PCR技术、寡核苷酸探针杂交、DNA芯片、蛋白质芯片技术等。一、基因诊断技术的发展与进步所谓基因诊断，是采用现代分子生物学技术直接探查基因的存在和缺陷，从而对

4、人体状态和疾（1）以探测基因为目标，属于“病病作出诊断。与传统的诊断方法比较，基因诊断有以下几个特点：（2）由于检测因诊断”，针对性强。且由于其应用技术以分子杂交为基本原理，故有很高的特异性；技术十分敏感，故诊断灵敏度相当高；（3）由于基因探针或引物可为任何来源，任何种类，所以适应性强，诊断范围广；（4）在感染性疾病的基因诊断中，不仅可检出正在生长的病原体，也能检出潜伏的病原体；既能确定既往感染，也能确定现行感染；既能诊断普通菌株或病毒，也能检出变异株；同时，能对那些不容易体外培养（如产毒性大肠杆菌）和不能在实验室安全培养（如立克次体）的

5、病原体作出诊断，所以大大扩大了诊断范围。近年来，基因诊断技术发展十分迅速，尤其是实时荧光定量PCR技术和基因芯片技术有了艽蟮慕梗谏镆窖Я煊颍òù静⊙Я煊颍┓⒒釉嚼丛酱蟮淖饔谩?（一）实时荧光定量PCR技术研究进展57所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。该技术于1996年由美国AppliedBiosystems公司首先推出，不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特

6、点，目前已得到广泛应用。在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念——Ct值。C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数（如图1所示）。图1.Ct值的确定PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold10SDcycle6-15研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷

7、贝数的对数，纵坐标代Ct值（如图2所示）。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。图2.荧光定量标准曲线58荧光定量PCR所使用的探针有许多种，现以TaqMan荧光探针为例将其原理简述如下：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DN

8、A链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。如图3所示。59图3TaqMan荧光探针工作原理SYBR荧光染料法进行实时荧光定量ＰＣＲ的原理和使用相对比较简单，只要