抗pla2g13多克隆和单克隆抗体的制备与鉴定

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1、抗PLA2G13多克隆和单克隆抗体的制备与鉴定：李淑珍,刘莹,陈苗,柳晓兰,唐小波,高建恩,朱大岭,孙启鸿【摘要】　　目的:制备分泌型的磷脂酶A2G13（groupXIIIsecretedphospholipaseA2,PLA2G13）的多克隆抗体（pAb）和单克隆抗体（mAb）,并对抗体进行特性鉴定。方法:以人正常肝cDNA文库为模板,构建重组表达质粒pGEX-4T-1-PLA2G13（即PLA2G13-GST）和pET-32a-PLA2G13（即PLA2G13-His）。PLA2G13-GS

2、T融合蛋白作为免疫原制备兔pAb和鼠mAb。采用r）约19700的蛋白,与文献报道中PLA2G13的实际Mr相符。通过筛选共获得8株可稳定分泌抗PLA2G13的杂交瘤细胞株,r）约21400,主要存在于细胞外基质,成熟型PLA2G13Mr约19700,其结构特征类似于磷脂酶家族另一个成员PLA2G12,但二者的组织分布呈现很大差别［1］。RNAblots结果展示PLA2G13基因在成人肝脏,小肠中表达,而在肾脏中则呈现较低水平的表达。生理条件下,分泌型磷脂酶家族参与炎症反应、宿主防御反应和动脉粥

3、样硬化等生物学过程。其家族成员多具有磷脂酶活性,而PLA2G13在其活性位点由亮氨酸突变为组氨酸,因此不具有磷脂酶活性。近年来的基因水平研究和蛋白芯片研究结果均显示PLA2G13在肝癌和肝硬化发生时基因和蛋白水平上调［2］。但是目前,PLA2G13基因在肝癌发生发展中的确切分子机制仍然不清楚。我们主要从构建重组表达载体入手,获得其融合表达蛋白后,免疫新西兰雄性大耳白兔和BALB/c小鼠,制备抗PLA2G13的多克隆抗体（pAb）和单克隆抗体（mAb）,并对抗体进行特性鉴定,为进一步研究PLA2G

4、13的功能及其在肝癌的发生,发展及治疗中的作用。　　1材料和方法　　1.1材料成人肝cDNA文库购自Cloech公司。大肠杆菌BL21感受态菌株为本实验室自制。pGEX-4T-1和pET-32a为Amersham公司产品。限制性内切酶EcoRI和XhoI、ExTaq酶、T4连接酶等购自TaKaRa公司。PCR回收试剂盒,质粒提取试剂盒购自OmegaBiotek公司。BALB/c小鼠和新西兰雄性大耳白兔购自军事医学科学院动物中心。小鼠骨髓瘤细胞株Sp2/0为军事医学科学院放射与辐射医学研究所免疫室

5、制备。Hbt小鼠mAb分型试剂盒购自HyCultbiotechnologyb.v.公司。鼠抗GST标签mAb、HRP-羊抗鼠IgG、HRP-羊抗兔IgG、ECL显色系统均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。　　1.2方法　　1.2.1PLA2G13抗原的制备和纯化根据HumanProteinReferenceDatabase中提供的PLA2G13的氨基酸序列,并结合应用生物信息学软件DNAstar的表位分析,综合设计引物。在其上游引物设计EcoRI酶切位点,下游引物设计XhoI酶切位点,片段全长2

6、97个碱基,以人正常肝cDNA文库为模板进行PCR反应。回收扩增目的片段,并将目的片段及pGEX-4T-1和pET-32a载体分别经EcoRI和XhoI双酶切并连接,转化入大肠杆菌,阳性克隆经测序正确后抽提质粒,进行诱导表达。PLA2G13在BL21细菌中以包涵体形式表达,收集蛋白并进行纯化。　　1.2.2PLA2G13-GST和PLA2G13-His融合蛋白的B显色。(2)r分别为38000和32000,与预测的PLA2G13融合蛋白的Mr相一致,表达量约占菌体总蛋白的50%～60%,融合蛋白

7、主要以包涵体的形式表达（图1）。通过Westernblot检测,应用抗GST和抗His的抗体能够在相应位置分别检测到PLA2G13-GST和PLA2G13-His融合蛋白（图2）。　　图1PLA2G13融合蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳分析（略）　　1:阴性对照（大肠杆菌BL21裂解蛋白）;2:大肠杆菌BL21中表达的PLA2G13-His融合蛋白;3:大肠杆菌BL21中表达的PLA2G13-GST融合蛋白.　　图2PLA2G13-GST和PLA2G13-His融合蛋白的r约38000和3200

8、0处各有一特异性的条带,说明此pAb可以特异性识别重组PLA2G13蛋白。r为19700蛋白,这与文献报道的PLA2G13的Mr一致,在Mr为62000~64000处也有一清晰条带,于其无活性形式蛋白Mr相符。阴性对照（兔免疫前血清代替一抗）在相应位置无条带（图3）。　　2.3杂交瘤细胞株的建立及抗体亚类的测定(1)经细胞融合、筛选及克隆化,获得8株能稳定分泌抗PLA2G13mAb的杂交瘤细胞株（AE093、BA071、BG091、CE073、DB082、DE061、EC051和EG071）。(