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时间:2018-05-03
《双菌株协同发酵提高红景天中苷和酪醇含量的研究》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在应用文档-天天文库。
1、双菌株协同发酵提高红景天中苷和酪醇含量的研究作者:宋伟舟,孙剑峰,刘玉应,冯敏,蒋春,邓小晨【摘要】目的从已分离的具有红景天苷转化能力的霉菌中,筛选能协同发酵红景天苷的双菌株组合。方法以重氮盐比色法初步确定菌株组合和双菌株协同主要发酵条件,并用高效液相色谱(HPLC)法复筛。结果选出的最优双菌株组合编号为35-42,该组合在最优发酵条件下,发酵后红景天中红景天苷和酪醇含量比原药材分别提高86.29%和118.14%,总有效成分提高94.68%。结论表明双菌株的协同转化作用明显优于单菌株。【关键词】双菌株发酵;红景天苷;
2、酪醇;重氮盐比色法;高效液相色谱红景天为景天科(Crassulaceae)红景天属RhodiolacrenulataHook.f.etThoms植物的根及根茎[1],我国红景天资源大多分布在高寒地区。其有效成分主要是红景天苷及其苷元-酪醇,二者均具有抗缺氧、抗疲劳、抗微波辐射、抗病毒、抗肿瘤等作用。红景天制品是抗高原反应的必备品。随着红景天产品广泛开发和应用,过度采挖使天然资源日趋枯竭[2],对高原藏区生态环境的破坏严重。因此,保护性开发野生资源,提高红景天有效利用率显得更加重要。在其他一些植物药材中,苷是从无活性的苷
3、元脱去糖基获得的,可以采用酸解或酶法来水解糖基,简便易行。与之不同,红景天苷和苷元生成是合成代谢,其前体来源不太清楚,从而造成提高其有效成分研究的难度。目前已有的研究主要包括:添加前体物和酶催化剂合成红景天苷、化学合成法[3]、植物细胞组织培养和基因克隆等方法[4,5],但与应用还有不小距离。文章在前期研究中,已分离到对红景天苷具有转化能力的菌株,通过单一菌株发酵,最高可使红景天原药材中苷含量提高52.83%。本研究进一步采用双菌株协同发酵红景天,使其中苷含量大大高于单一菌株发酵。混合菌株发酵提高红景天苷和酪醇含量研究
4、还未见报道,为利用生物技术提高野生藏药材资源利用率提供新途径。 1材料红景天购于成都五块石药材市场,经四川大学生命科学学院许介眉教授鉴定系景天科(Crassulaceae)红景天属RhodiolacrenulataHook.f.etThoms。菌种:本实验室保存,除2号为米曲霉外,其余菌株均为黑曲霉。培养基:红景天发酵培养基:红景天粉与水以1∶10的比例。固体种子培养基:麸皮∶水=1∶1。液体种子培养基:麸皮∶水=1∶5,煮沸20min,过滤,取滤液,加MgSO40.05%,KH2PO50.1%,(NH4)2SO40
5、.1%。试剂:酪醇标准品、红景天苷标准品均购于成都思科华有限责任公司,甲醇为一级色谱纯。 2方法 2.1培养方法 2.1.1孢子悬液制备将菌株接种于固体种子培养基,30℃培养48h,加水洗下孢子,稀释至孢子浓度约108个/ml。 2.1.2菌丝体制备按0.1%接种量将孢子悬液接入液体种子培养基,30℃,200r/min,时间48h。 2.1.3红景天发酵培养30℃,200r/min,时间为2~4d。 2.2提取方法红景天发酵液用75%的乙醇按照1∶8的比例分别提取3次,合并滤液,得到发酵提取液,用于重氮盐比
6、色法测定和HPLC检测。 2.3测定方法 2.3.1重氮盐比色法[6]取发酵提取液5ml,加入10%的醋酸铅5ml和饱和硫酸钠2ml,定容至25ml,沉淀、离心,取上清液5ml于20ml比色管中,其中加2%碳酸钠3ml及重氮化试剂3ml,摇匀显色5min,再加5%氢氧化钠0.5ml,显色15min,整个过程在4℃以下进行,稀释10倍,在489nm波长下测定吸光度。以吸光度高低作为总有效成分(苷和酪醇的总量)的初筛指标。 2.3.2HPLC检测[7]色谱条件:岛津LC-6A高效液相色谱仪;色谱柱为Y-C18(10u
7、)200nm×4.6mm;流动相为V(甲醇):V(高水)=25∶75;检测波长275nm;自然pH;柱温为室温;进样量:20μl;流速1.0ml·min-1。精密称取红景天苷、酪醇标准品25.00mg,分别置于25ml的容量瓶中,无水乙醇溶解定容,制成浓度为1.00mg·ml-1的标准品,取苷标准品溶液进样2,4,6,8,10,12μl,酪醇标准品溶液进样1,2,3,4,5,6μl,测定峰面积,以峰面积(Y)与对照液中红景天苷和酪醇的质量(X/μg)作回归计算,得到标准曲线。发酵产物中红景天苷和酪醇的含量测定按以上条件
8、进行。 3结果 3.1双菌株初筛在本研究前期的菌株筛选工作中,已对重氮盐比色法和HPLC进行对比测定,证明重氮盐比色法测定红景天总有效成分的结果,与HPLC测定值有较好的相关性(另文发表)。从已分离到的微生物中,选出发酵能力较高的8株霉菌,两两组合,接种于红景天发酵培养基中进行混合菌株发酵,并与单菌株发酵比较。结果见表1和图1
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