神经生长因子诱导神经母细胞瘤分化的研究

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1、神经生长因子诱导神经母细胞瘤分化的研究【摘要】　　目的观察神经生长因子（NGF）对神经母细胞瘤(neuroblastoma，NB)细胞增殖的抑制和可能的分子机制及NGF-TrkA信号传导途径在NB细胞分化中的作用。方法取本院住院患儿新鲜手术标本，进行原代细胞培养作为细胞模型，通过台盼蓝拒染法计数活细胞；观察NGF干预前后细胞形态学变化；MTT法检测细胞的增值活性；RT-PCR分析TrkA表达情况。结果NGF作用NB细胞后，细胞形态发生显著变化，并可剂量依赖性的抑制细胞增殖，2d时TrkA表达增加，4d以后出现

2、TrkA表达的明显增加。结论NGF对NB细胞体外增殖有抑制作用并诱导其分化，且表现剂量依赖关系；NGF可诱导NB细胞分化成熟及TrkAmRNA表达水平增高，可能是NGF诱导NB细胞分化逆转的分子生物学机制之一。【关键词】神经母细胞瘤神经生长因子细胞分化　　【Abstract】ObjectiveToinvestigatethedifferentiationandproliferationofneuroblastoma(NB)cellsinducedbynervegroechanisms.MethodsNBtum

3、ortissuesarycellcultureed.Trypanblueexclusionicroscope.ThechangeofcellproliferationinedbymeansofMTTassay.TrkAexpressioninedbyRT-PCRmethod.ResultsByday2,thealivecellsofgroupA、BandCdecreasedbytreatmentofNGF;morphologicalchangesofNBcellsRNAexpressionincreasedf

4、romday2andreacheditspeakonday8inatimeanddosedependentmannerbytreatmentofNGF.ConclusionNBcellstreatedbyNGFdifferentiatetoneuron-likecellsandthecellgroanner.TrkA'sexpressionisincreasedbyNGF.ThismaybeoneofthemechanismsofspontaneousregressionofNB.　　【Keyanervegr

5、oa，NB)是起源于胚胎期神经嵴细胞的儿童恶性肿瘤，自然退化常见于新生儿、婴儿和早期肿瘤，而较大儿童晚期患者恶性程度高，预后差。对化疗耐药是治疗失败的主要原因［1］。如何应用人为方法使NB细胞分化、逆转、消退，是当今肿瘤界研究的热点问题［2］，用药物诱导NB向良性转化可能成为临床治疗的一个新途径。　　1资料与方法　　1.1一般资料　　5岁男性患儿，因发现“腹部肿物”1周，于2004年6月10日入住本院，行腹部B超、CT检查，考虑为神经源性肿瘤；于2004年6月12日行剖腹探查、腹部肿物切除术。手术标本冰冻切片

6、提示神经母细胞瘤。为Evans分期Ⅲ期，无远处转移，术后病理诊断：神经母细胞瘤。　　1.2研究方法　　(1)试剂：NGF购自晶美公司；MTT购自华美公司。其它均为国产分析纯试剂。Trizol购自美国GBICO公司；RT-PCR试剂盒购自Promega公司；TaqDNA合成酶、琼脂粉购自上海生工生物工程公司；DNAMarker购自宝生物工程大连公司；引物TrkA引物序列根据Genebank资料设计如下：TrkAsense:CTGGGCGGAGTGCCTGAA，antisense：GGCTC-CGGCTCCAGG

7、AA，扩增产物为528bp，TrkA引物及β-actin(114bp)内参照引物由北京赛百盛公司合成。(2)NB细胞培养：用消化法进行原代细胞培养，培养基为DMEM，含10%胎牛血清、青霉素100U/ml、链霉素0.1mg/ml，在5%CO2、95%空气环境中恒温恒湿孵育。(3)实验分组：用作生长及分化研究的NB细胞分成4组。A组：DMEM培养基加入NGF使终浓度为5μmol/L；B组：DMEM培养基加入NGF使终浓度为10μmol/L；C组：DMEM培养基加入NGF使终浓度为20μmol/L；D组：作为对照

8、组，培养基中不加NGF干预。每组设4份同样的标本。(4)活细胞计数：取指数生长期细胞，接种至24孔培养板,细胞浓度为1×105细胞/ml，于0、2、4、6、8d用台盼蓝拒染法计数活细胞。(5)细胞形态学观察：用作分化研究的细胞，以1×103/ml密度接种至25ml培养瓶中，A、B、C、D组同时接种，于0、2、4、6、8d在相差显微镜下计数分化细胞。方法：对每瓶细胞选取5个不同视野的200个细胞，根据