拉米夫定治疗慢性乙型肝炎的临床观察及ymdd耐药变异株检测

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1、拉米夫定治疗慢性乙型肝炎的临床观察及YMDD耐药变异株检测作者：涂海健，林国贤，郭金者，许光辉，刘信禹，周燕锋【关键词】拉米夫定［摘要］目的：探讨拉米夫定在治疗慢性乙型肝炎患者的疗效以及监测拉米夫定临床治疗过程中耐药性的产生，更好地指导临床用药。方法：对117例用拉米夫定治疗的慢性乙型肝炎患者，进行HBVDNA含量、ALT、HBeAg检测以观察其疗效，同时对出现治疗后HBVDNA反弹和ALT回升的患者，进行乙型肝炎病毒聚合酶基因(Pgene)酪氨酸-蛋氨酸-天门冬氨酸YMDD位点变异性测定。结果：拉米夫定治疗2个月、6个

2、月、12个月、18个月后HBVDNA阴转率分别为86．2％、90．6％、84．6％、82．1％，HBVDNA含量下降明显。ALT复常率为10．3％、68．4％、82．9％、81．2％。HBeAg的阴转率相对较低为0．85％、3．4％、16．2％、36．8％。117慢性乙型肝炎患者拉米夫定治疗6个月后YMDD变异2例，12个月16例，到18个月累计共有19例YMDD变异阳性的患者，占16．2％，其中以YVDD变异为主，YVDD变异14例，占73．7％，而YIDD变异仅5例，为26．3％。发生YMDD变异的患者HBVDNA含

3、量以及ALT回弹，HBeAg发生阳转。结论：拉米夫定是一种乙型肝炎抗病毒治疗新药，具有很强的抑制HBV复制的作用，对慢性乙型肝炎有较好的临床疗效。但随拉米夫定长期服用可能出现耐药性，主要是由HBVP基因区YMDD的变异所引起的，产生YIDD、YVDD耐药突变株，对YMDD耐药变异株的监测，为抗病毒治疗提供分子生物学依据以及指导临床用药。［关键词］拉米夫定；慢性乙型肝炎；YMDD变异拉米夫定是一种新抗HBV药物，为核苷类似物、逆转录酶抑制剂，具有很强抑制HBV复制的作用，对慢性乙型肝炎治疗具有较好的临床疗效，但长期服用拉米

4、夫定，部分患者可产生拉米夫定耐药，研究表明，拉米夫定耐药是HBV病毒逆转录酶编码区发生变异，特别是HBV聚合酶基因P基因活性区发生YMDD变异为最常见和重要［1～4］。笔者观察117例慢性乙型肝炎患者拉米夫定治疗效果，YMDD变异情况以及他们的临床表现，现报道如下。1资料与方法1．1病例选择117例病人均为我院门诊或住院慢性乙型肝炎患者，其中男91例，女26例，年龄12岁~67岁，诊断均符合2000年全国传染病与寄生虫病分会、肝病学分会修订的病毒性肝炎防治方案的诊断标准，服用拉米夫定前，117例慢性乙型肝炎患者ALT&g

5、t;80μl/L(正常高值的两倍)，HBVDNA>106copy/ml，拉米夫定治疗剂量为100mg/d，排除其他原因引起的肝功能损害。定期随访，发现治疗过程中有HBVDNA含量或ALT同弹者收集其血清标本，-20℃保存，以备YNDD耐药突变株测定。1．2血清标志物与肝功能测定血清标志物由意大利AlisEi全自动酶免分析仪测定，试剂为厦门新创公司提供，肝功能用贝克曼CX9生化仪分析，试剂贝克曼公司提供。1．3HBV-DNA定量Roche公司生产Lightcycler实时荧光定量扩增仪测定，深圳市匹基生物股份有限公司

6、提供试剂，检测范围为4．2E+02~4．2E+08。1．4YMDD耐药变异株测定Roche公司Lightcycler实时荧光PCR扩增仪测定。熔点曲线法(寡核苷探针与模板结合时，不匹配碱基显著影响熔解温度的原理，采用PCR体外扩增方法结合杂交探针荧光检测技术)，用Lightcycler软件对结果进行分析，试剂为深圳市匹基生物股份有限公司提供。1．4．1质控标准阴性对照的Ct值应无数值，无Tm值：Ct野生型YMDD对照(30．0，Tm值参考值为50．0℃；Ct突变型YIDD对照(30．0，Tm值参考值为42．5℃；Ct突变

7、型YVDD对照(30．0，Tm值参考值为55．5℃；上面任何不符，则应重新进行PCR检测。1．4．2野生型与突变型分析要求：A：Tm=Tm(YMDD对照品)±1.5℃，判为野生型YMDD；B：Tm=Tm(YVDD对照品)±1．5℃，判为突变型YVDD；C：Tm=Tm(YIDD对照品)±1．5℃，判为突变型YIDD。2结果2．1拉米夫定治疗后临床主要指标HBVDNA，ALT，HBeAg检测结果观察拉米夫定(100mg/d)治疗2个月、6个月、12个月、18个月后患者人体外周血HBVDNA含量和肝功能主要指标ALT及HBeA

8、g情况，发现服用拉米夫定后，患者外用血中的HBVDNA含量(对数表示)迅速下降或转阴，ALT(1U/L)伴随HBVDNA含量迅速降低也逐渐下降，HBeAg出现阴转结果，见表1。表1拉米夫定治疗2个月~18个月后临床主要指标HBV（略）2．2YMDD耐药变异株检测结果117例慢性乙型肝炎患者进行拉米夫定治疗后(100m