抗β淀粉样蛋白单抗杂交瘤的建立及免疫学特性的分析

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1、抗β淀粉样蛋白单抗杂交瘤的建立及免疫学特性的分析作者：赵满仓魏文青张艳焦娟刘晶付瑶【摘要】目的制备抗β142淀粉样蛋白（Aβ142）单克隆抗体，并对其免疫学特性进行了分析，为进一步探讨阿尔茨海默病（AD）的发病机制打下基础。方法用合成的Aβ142偶联血蓝蛋白（KLH）制成抗原，免疫BALB/c小鼠制备抗Aβ142单克隆抗体，并对抗体的免疫学特性进行分析。结果从24个阳性孔中筛选出6株特异性好效价高的细胞株，命名B1～6，其中B2、B3、B4、B6属于IgG2a亚型，而B1、B5属于IgG

2、2b亚型。测得相对亲和力B6＜B1、B4＜B2＜B3、B5。结论成功制备出特异性好、效价高的抗Aβ142蛋白单抗杂交瘤细胞株，为下一步的深入研究打下基础。【关键词】β142淀粉样蛋白；阿尔茨海默病；单克隆抗体；免疫学特性大量的流行病学、神经病理学及动物模型研究等均证明了β淀粉样（βamyloid，Aβ）蛋白在阿尔茨海默病（AD）的发病及发展中起着关键性作用〔1～3〕。因此，许多治疗AD的方法靶向减少Aβ产生和清除Aβ沉积。Schnek等〔4〕用人工合成的Aβ142多肽免疫PDAPP小鼠

3、，10月龄以上的动物模型出现老年斑的现象基本被控制。Janus等〔5〕在转基因小鼠分别进行了Aβ的免疫接种实验，不但使动物的Aβ过载得以减轻和老年斑的出现明显减少，而且观察到疫苗对动物模型的认知功能障碍具有预防作用。为此，国内外许多学者都致力于研制针对Aβ不同片段的多克隆及单克隆抗体，用于AD的免疫治疗研究。此外，Aβ抗体还可用于AD的诊断和预防的研究。本研究以合成的Aβ142免疫BALB/c小鼠，利用传统的杂交瘤技术，建立了稳定分泌单抗的6个杂交瘤细胞株，并对所得6株单抗的特异性和亲合力进行

4、了分析。　　1材料与方法　　1.1主要试剂　　Aβ142多肽由北京博奥森生物技术有限公司采用FMOC有机化学固相合成法合成，HPLC纯化，纯度90%以上；用BDB法偶联载体蛋白KLH（血蓝蛋白）。HRP羊抗鼠IgG、BCA蛋白检测试剂盒博奥森产品；DMEM培养基、氨甲蝶呤、胸腺嘧啶核苷、次黄嘌呤购自北京化学试剂公司。PEG4000由卫生部北京老年医学研究所惠赠。　　1.2动物　　BALB/c小鼠，8周龄，购自中国医学科学院动物繁育中心；SP2/0小鼠骨髓瘤细胞，由军事医学科学院五所惠赠。　

5、　1.3单克隆抗体的制备　　1.3.1动物免疫　　取1mg合成的Aβ142KLH抗原与福氏完全佐剂充分混合后，于BALB/c小鼠皮下多点注射，2g与不完全福氏完全佐剂充分混合后，皮下多点注射，融合前3d，取纯抗原100μg/0.1ml由脾脏直接注入。　　1.3.2细胞融合　　融合前1d按照常规方法制备饲养层细胞。取处于对数生长期的SP2/0小鼠骨髓瘤细胞与免疫的小鼠脾细胞以1∶8～1∶10比例在50%PEG的作用下进行融合，用GKN洗二遍，收集细胞，加入含20%胎牛血清的DMEMHAT的选择

6、培养基混匀，种在96孔含有滋养细胞的板孔中。　　1.3.3杂交瘤阳性细胞株的筛选　　待克隆生长至孔径的1/3时取上清进行检测。用含Aβ14220mg/ml的碳酸缓冲液（pH9.5）包被96孔酶标板，4℃过夜，PBS洗3次，加培养上清，37℃孵育2h，洗3次，加HRP羊抗鼠IgG，37℃孵育2h，加底物显色。选取阳性孔采用有限稀释法克隆化，待克隆阳性率达100%时扩大培养，制备腹水。　　1.3.4效价测定　　取腹水用生理盐水稀释成不同浓度，用ELISA法测定其效价。　　1.3.5抗体纯化　　取

7、腹水加等量的饱和硫酸铵进行纯化，用0.1mol/L、pH7.4的PBS进行透析。　　1.3.6抗体蛋白含量的检测　　BCA方法，按照说明书进行。　　1.4抗体免疫学特性分析　　1.4.1特异性测定　　取Aβ142抗原、牛血清白蛋白、血蓝蛋白包被酶标板，按上述1.3.3中的方法进行测定，观察其交叉反应。另外用Western印迹检测抗体的特异性。将纯Aβ142蛋白溶解后，进行TristricinePAGE，转膜，用5%脱脂奶粉溶于TBST封闭，将小鼠Aβ抗体腹水用TBST按1∶1000稀释，作

8、为一抗孵育，二抗用HRP山羊抗小鼠IgG，也用TBST1∶1000稀释，显色后观察。　　1.4.2Ig及亚类鉴定　　用双向免疫扩散法。　　1.4.3亲合力测定　　包被Aβ142抗原，4℃过夜，次日加入系列稀释的纯化抗体（McAb），37℃孵育2h，洗涤后加入HRP羊抗鼠IgG，37℃孵育2h，加底物显色。以McAB浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制饱和曲线。当McAb达到一定浓度时，反应曲线出现平峰，该McAb浓度即系100%结合浓度，而50%最大结合浓度的吸光度为100%结合浓度吸光度的一