rhbmp┐2对成纤维细胞成骨表型的影响

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1、rhBMP┐2对成纤维细胞成骨表型的影响　　摘要:目的研究rhBMP-2对成纤维细胞成骨表型的影响，探讨成纤维细胞成骨条件.方法向体外培养的成纤维细胞（NIH3T3细胞）内加入不同浓度的rhBMP-2，在第3日和第6日检测碱性磷酸酶（ALP）活性和骨钙素表达，绘制生长曲线.结果rhBMP-2可增加成纤维细胞ALP活性，促进骨钙素表达，在rhBMP-2浓度为800μg・mL-1和1200μg・mL-1作用最强.rhBMP-2对细胞增殖规律无明显影响.结论rhBMP-2可促进成纤维细胞成骨表

2、型表达.　　Keyorphogeicprotein;pheno-type　　Abstract:AIMToinvestigatetheeffectofrhBMP-2onos-teogenicphenotypeoffibroblastanddiscusstheconditionthatfacilitatesosteogenesisoffibroblasts.METHODSrhBMP-2indifferentconcentrationulatedtheex-pressionofosteocalcin.P-2hadnoef

3、fectonproliferationoffibroblasts.CONCLUSIONrhBMP-2couldstimulatetheexpressionofosteogenicphenotypeoffibroblastsinvitro.　　0引言　　组织工程学由三个要素组成，即:种子细胞、调节细胞生长与增殖的细胞因子和支持细胞生长的细胞外基质.在骨组织工程学的研究中，种子细胞可有较多选择，而成纤维细胞因在体内存在范围广泛、取材方便、容易培养而得到研究者的重视.但在何种条件下成纤维细胞可向成骨细胞方向转化，目前研究

4、不多.本研究旨在探索在rhBMP-2作用下成纤维细胞成骨表型的变化.　　1材料和方法　　1.1材料　　DMEM、小牛血清、牛胰蛋白酶（华美公司）;rhBMP-2（本校生物化学教研室提供）;碱性磷酸酶（ALP）检测试剂盒（广东佳标生物制品公司）;骨钙素放射免疫检测试剂盒（北京东亚免疫技术研究所）;Heraus细胞培养箱（德国）;Hitach2006型紫外分光光度计（日本）;γ-射线检测仪（美国CapintecInc）.NIH3T3细胞由本校口腔医学院口腔生物教研室提供，DMEM/200mL・L-1小牛血

5、清（DMEM/200mL・L-1BS），50mL・L-1CO2，37℃培养，2.5g・L-1牛胰蛋白酶消化传代，按2×103/孔传代至96孔培养板内，同一条件下培养.　　1.2方法　　1.2.1rhBMP-2对成纤维细胞的作用　　将rhBMP-2溶解于DMEM中，针头滤器过滤除菌，质量浓度为10g・L-1;细胞传代24h后，向每个培养孔内添加rhBMP-2，并使其终质量浓度分别为0，100，200，400，800，1200和1600mg・L-1，

6、分别在培养3和6d停止培养，检测碱性磷酸酶（ALP）活性和骨钙素表达.各组培养的细胞在培养过程中每日计数细胞的数量，并绘制细胞生长曲线.培养的细胞同时行光镜观察.　　1.2.2ALP活力的检测　　将培养至3和6d的细胞培养孔内培养基吸除，并用0.01mol・L-1PBS洗涤3次，0.1g・L-1TritonX-100处理细胞过夜（50μL/孔），然后向培养孔内加入ALP缓冲液100μL/孔，37℃保温25min，加入显色剂100μL/孔，37℃处理5min，紫外分光光度计上检测其吸光度，

7、并绘制直方图.培养的细胞同时行钙-钴法ALP染色.　　1.2.3骨钙素表达的检测　　按照试剂盒操作说明操作，将γ-计数仪测量结果绘制标准曲线.　　2结果　　2.1成纤维细胞形态学　　正常成纤维细胞（NIH3T3）为长梭型，细胞突起较少，细胞内颗粒也较少.在rhBMP-2作用下，细胞形态发生明显变化，表现为细胞突起增多，胞体增宽、增大，细胞内颗粒状物质增多.钙-钴法染色显示细胞内的颗粒为碱性磷酸酶颗粒.亦即说明在rhBMP-2作用下，细胞内ALP颗粒增多.　　2.2成纤维细胞ALP活性　　正常成纤维细胞内有一定水平A

8、LP的表达.在rhBMP-2作用下，细胞ALP活力明显增高，随着rhBMP-2质量浓度的增加，ALP活力逐渐增强;当rhBMP-2质量浓度为1200g・L-1时对ALP活力促进作用最大.随着时间的延长，成纤维细胞ALP活性有所增加（Fig1），考虑到细胞数量的增加，所以rhBMP-2对ALP的促进作用可能并不一定随着时间的延长而增强.在细胞培养