肾素原受体系统在糖尿病视网膜病变中的作用

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1、肾素原受体系统在糖尿病视网膜病变中的作用　　糖尿病性视X膜病（diabeticretinopathy,DR）是糖尿病性微血管病变中最常见的并发症，也是糖尿病最严重的并发症之一。糖尿病视X膜病变的病因复杂，至今发病机制不明。糖尿病视X膜病变主要以氧化作用造成视X膜的损伤，8-羟脱氧鸟苷（8-hydroxy-2'-deoxyguanosine,8-OHdG）可以标记氧化应激损伤，通过免疫组化法可以检测出8-OHdG的表达。研究[1]显示，肾素血管紧张素系统（rennin-angiotensinsystem,RAS）的激活

2、是DR发生发展的风险因素，阻断RAS系统可以抑制糖尿病视X膜病变的发展。慢性高血糖可以激活RAS在眼内发挥作用从而导致DR的进一步发展。血管紧张素Ⅱ是RAS的主要效应分子，其通过收缩血管的作用强效升高全身和局部血压，研究[2]显示血管紧张素Ⅱ受体（angiotensinⅡreceptors2,AT2R）也存在于视X膜及其他眼内组织。肾素原受体[（pro）renninre-ceptor,PRR]为RAS系统成员之一。细胞外调节蛋白激酶（extracellularsignal-regulatedkinase,ERK）分为ERK1

3、和ERK2,统称为ERK1/2,被激活后进入细胞核促进某些基因的转录和表达，与细胞的增殖分化有关。CD14和8-OHdG免疫组化染色了解新生血管的产生和视X膜神经细胞的凋亡的情况，该实验旨在通过观察不同病程糖尿病视X膜病变大鼠视X膜中AT2R的含量以及ERK1/2、磷酸化ERK1/2（p-ERK1/2）蛋白的表达及CD14、8-OHdG的表达，了解RAS系统在糖尿病视X膜病变中的作用。　　1材料与方法　　1.1实验动物健康雄性SD大鼠50只，普通级，2月龄，190±20g,由安徽医科大学实验动物中心提供，随机分

4、为正常组（10只）和糖尿病组（38只）。实验期间各组大鼠均自由饮水和进食（普通饲料喂养）。　　1.2主要试剂及仪器链脲佐菌素（streptozocin,STZ）购自美国Sigma公司；ERK1/2单抗和兔抗磷酸化ERK1/2多抗购自美国SantaCruz公司；TR-Izol、MMLV购自美国GibcoBRL公司；内参β-actin单抗购自武汉博士德公司；ECL化学发光试剂盒购自美国Pierce公司。　　1.3糖尿病大鼠模型建立适应性饲养1周，1周后将（200±20）g的48只大鼠作为研究对象，血糖检测

5、均正常。依据文献[3],大鼠一次性单剂量腹腔注射STZ50mg/kg溶于柠檬酸盐缓冲液中（临用前以1∶1混合柠檬酸与柠檬酸钠，pH4.5），对照组给予等剂量柠檬酸盐缓冲液；48h后采用罗氏血糖仪测定尾静脉血糖，血糖≥16.9mmol/L认为糖尿病模型建立成功。模型建立后观察1周后测量血糖，将血糖稳定在16.9mmol/L以上作为糖尿病组，此时开始计算糖尿病鼠病程。　　1.4样本制备于病程4、8、12周分别处死大鼠，对照组各3只及糖尿病组各7只，10%水合氯醛麻醉，5ml/kg,放血处死，取其双眼，快速在显微镜下冰上分离

6、视X膜组织，EP管冻存于-80℃，2只眼分开保存。　　1.5免疫组化染色使用免疫组化三步法：石蜡切片脱蜡至水。3%H2O2室温孵育5~10min以消除内源性过氧化物酶的活性。蒸馏水冲洗，PBS浸泡2次，每次5min.5%~10%正常山羊血清（PBS稀释）封闭，室温孵育10min,倾去血清，勿洗。滴加一抗工作液，37℃孵育1~2h或4℃过夜。PBS冲洗3次，每次3min.滴加适量生物素标记二抗工作液，37℃孵育30min.PBS冲洗3次，每次5min.滴加适量的辣根酶标记的链霉卵白素工作液，37℃孵育30min.PBS冲洗，3

7、次每次5min.DBA稀释50倍显色10min,自来水充分冲洗、复染、脱水、透明、封片。采用激光共聚焦显微镜进行观察，ImageProPlus6.0软件分析图像，以上切片每组随机抽取10张切片进行光密度分析，记录每张片子的光密度（opticaldensity,OD）值。　　1.6检测AT2R受体mRNA表达由基因库查得大鼠AT2R的mRNA核苷酸序列，取视X膜组织100mg,加液氮研碎后，用TRIzol提取总RNA.实验组和对照组分别取1μg总RNA以MMLV为逆转录酶作逆转录反应。cDNA产物保存于-20℃。优化扩增

8、条件，使PCR扩增在对数期内进行。在DNA扩增仪上进行AT2R的PCR扩增30个循环。AT2R的退火温度为62℃。取PCR扩增产物5μl在1.5%琼脂糖中电泳，ImagemasterVDS成像系统摄影存盘后应用计算机图像分析软件（TotallabV1.01）行灰度扫描分析。以目的基因