基于相对和绝对定量同位素标记技术的脾气虚大鼠回肠蛋白质组学研究

《基于相对和绝对定量同位素标记技术的脾气虚大鼠回肠蛋白质组学研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在应用文档-天天文库。

1、基于相对和绝对定量同位素标记技术的脾气虚大鼠回肠蛋白质组学研宄麵贾连群王德山单德红张哲杨关林辽宁中医药大学中医脏象理论及应用教育部重点实验室辽宁省中医转化医学研宄中心辽宁中医药大学基础医学院辽宁中医药大学附属医院目的:应用相对和绝对定量同位素标记（iTRAQ）技术研究脾气虚大鼠冋肠蛋白质组的表达，寻找有意义的差异蛋白，为探索脾气虚证的现代科学本质提供新的实验方法与依据。方法：12只健康雄性SD大鼠随机分为正常组和脾气虚组，脾气虚组采用饮食不节加力竭游泳方法造模，15d后分离提取回肠总蛋白，以iTRAQ试剂标记后进行质谱检测，并对差异表达的蛋白进行生

2、物学分析。结果：与正常组比较，脾气虚组冋肠271个上调蛋白，303个下调蛋白；Pathway显著性富集分析确定下调差异蛋內参与的主要生化代谢途径和信号转导途径有细胞外基质受体交互作用、黏着斑等19条，上调差异蛋白参与包括PPAR信号通路、甾类激素生物合成在内的通路24条。选择细胞外基质受体交互作用为兴趣通路，发现与小肠屏障功能密切相关的层粘连蛋白、胶原蛋白以及整合蛋白等19个蛋白发生下调。结论:脾气虚证可能与冋肠细胞外基质受体交互作用通路改变及冋肠黏膜屏障功能受损相关。关键词：脾气虚证;蛋白质组;相对和绝对定量同位素标记;细胞外基质受体交互作用;冋

3、肠；“脾”不仅自身具有重要的生理功能，同时能够为营卫的运行及其他脏腑提供物质基础。脾气虚是临床上常见的中医证候，既可以导致脾主运化功能失常而出现消化系统症状，又能影响它脏导致神经、免疫、内分泌、血液等多系统疾病。因此对于脾气虚证本质的深入研宄具有重要的理论与临床意义。蛋白质组学可以较为全面地反映问题的本质，它研宄的是一个细胞乃至整个机体在一定时间或一定状态下，由基因组所表达的全部蛋白质m,与中医中“整体观念”的理论颇相一致。相对和绝对定量同位素标记（isobarictagsforrelativeandabsolutequantitation,iTR

4、AQ）技术是一项体外同位素标记技术，2004年由美国应用生物系统公司推出，目前己经成为差异蛋白质组学定量研宄的主要工具之一m。该技术可以同时对1个复杂的混合体系中的所有蛋白质进行精确的定量和鉴定，在寻找和发现区别于正常生理状态下的疾病特异表达蛋白质，阐明疾病的发病机制方面发挥了重要作用。虽然蛋白质组学技术越来越多的应用到脾虚证本质的研宄屮但是采用iTRAQ技术的研宂却鲜有报道。本实验以脾气虚大鼠回肠组织为研宄对象，采用iTRAQ技术对蛋白质组进行质谱检测，寻找、发现和分析有明显表达差异的蛋白质，为探索脾气虚证的现代科学本质提供新的实验方法与依据。材

5、料1.动物SPF级雄性SD大鼠12只，10-12周龄，体质量（200±10）g,购于本溪实验动物中心，许可证号:SCXK（辽）-2010-0001。于辽宁中医药大学实验动物屮心饲养，自由摄食与饮水。2.试剂与仪器TMTKit（批号:90066，Thermo,美国），SequencingGradeModifiedTrypsin（批号：V5113,Promega,美国），氰化甲烷（批号:PI85188,FisherChemical,美国），三氟乙酸（批号:91707,Sigma-Aldrich,美国），甲酸（批号:09676,Fluka,美国），碘乙酰

6、胺（批号：I1149,Sigma,美国），二硫苏糖醇（批号:43815,Sigma,美国），2-DQuantkit（GEHealthcare,美国），BCA蛋白定量测定试剂盒（批号:37B00150，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，中国）。低速冷冻离心机（Thermo,美国），干式恒温器酶标仪MultiskanFC型（Thermo,美国），垂直板电泳装罝（Bio-Rad,美国），Trans-BlotSD半干转印（Bio-Rad,美国）。方法1.分组、造模与取材12只SPF级雄性SD大鼠，随机分为正常组、脾气虚组（每组6只）。造模时间为15d,脾气

7、虚组大鼠采用饮食不节加力竭游泳方法（先饱食Id,再禁食2d，3d为1个循环，期间自由饮水，并每日游泳至力竭）进行造模M。第15天晚所有大鼠禁食禁水，次H4%水合氯醛0.5mL/100g腹腔麻醉后，分离回肠组织保存于-8（TC冰箱备用。2.iTRAQ定量蛋白质组学分析首先进行蛋白抽提，将用液氮研磨的样品转移到5mL离心管中，加入裂解液后置于冰上，用高强度超声处理器处理3次，40C、20000g离心lOmin取上清液，用预冷15%拧檬酸_20°C沉淀蛋白2h。4°C5000g离心lOmin弃上清液，预冷丙酮清洗沉淀3次，缓冲液溶解蛋白及含量测定。接着分

8、别进行胰蛋闩酶消化、TMT标签、高效液相色谱分离，液相串联质谱分析、最后用Mascot2.3.0软件在蛋白质数据库屮搜索肽