紫茎泽兰多糖的免疫调节活性研究

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1、主题策划FEATURE紫茎泽兰多糖的免疫调节活性研究12万春燕,周绪斌(1.中国农业大学，北京100093;2.新疆天康畜牧生物技术股份有限公司，新疆乌鲁木齐830032)摘要：紫茎泽兰是多年生草本或亚灌木。20世纪40年代由缅甸传入中国云南后，迅速在西南地区扩散，破坏了植物的群落结构、畜牧业生产和农业生产。通过研究紫茎泽兰提取物中的多糖成分，首次发现其具有免疫活性。为研究紫茎泽兰多糖（EAP）的免疫调节作用，试验用4个不同剂量的紫茎泽兰多糖50μg/mL，100μg/mL，200μg/mL和400μg/mL刺激人源（A549）细胞和鼠源（RAW264.7）细胞，分别作用12h，24h和

2、36h，用荧光定量PCR测定细胞因子白细胞介素（IL-6）,肿瘤坏死因子（TNF-α）,干扰素（IFN-β和IFN-γ）的表达情况，结果表明EAP浓度为200μg/mL，作用时间为36h时这4种细胞因子的表达水平都较高。对于免疫佐剂的开发或免疫调节剂的研制具有重要作用。关键词：紫茎泽兰多糖；免疫；细胞因子1紫茎泽兰多糖的提取50,100,200,400μg/mL，另外设脂多糖（LPS）组，每个梯取100 g阴凉处干燥的紫茎泽兰叶片，将叶片剪碎，辗度3个重复。空白对照加入200 μL相应的磷酸缓冲（PBS）液。成粉，40目过滤筛过滤。再将其溶于1 000 mL蒸馏水中，3)培养12 h,2

3、4 h,36 h每个浓度取3个样品，提取细胞于超声波提取装置中提取40 min，收集上清液，沉淀物再悬总RNA，采用荧光定量PCR方法检测紫茎泽兰多糖的免疫浮于1000 mL蒸馏水，再次通过超声处理提取30 min，将得相关细胞因子IL-6，TNF-α,IFN-β，IFN-γ等。到的上清液与前一次所得合并，最后在旋转蒸发器中将水相3.2采用Trizol法提取细胞总RNA，采用随机引物合蒸发至干，得到的残留物溶解在蒸馏水中，并在4℃下冷冻成cDNA保存。3.3荧光定量PCR2紫茎泽兰多糖的纯化制备用β-actin作为内参。获得的实时定量PCR数据用将萃取液在3 000 g/min离心25 

4、min，80 ℃下进行浓缩2-ΔΔCT方法分析相关基因的表达。8 h，以制备多糖，将上清液用Sevag法脱蛋白。必要时可用3.4数据分析紫外分光光度计测 250～280 nm没有吸收峰方可确定除净了使用GraphPad Prism V5.01作图并进行统计学分析。P蛋白。将上层清液用2 mol/L 氢氧化钠调至pH=7，加热回流＜0.05为差异显著，在图中用“*”表示。用1%活性炭脱色。4结果取除杂蛋白后的溶液10 mL,装入截留分子量为4.1紫茎泽兰多糖对人源细胞（A549）的免疫调节作用8 000～15 000的透析袋中透析脱盐及小分子杂质，透析液4.1.1不同浓度的EAP对A549

5、细胞的影响离心（3 000 r/min,10 min），上清于80 ℃水浴浓缩至原体实验选取的紫茎泽兰多糖浓度分别为50μg/mL、积的1/3。然后加入4倍体积95％乙醇（v/v）沉淀24 h后，100μg/mL、200 μg/mL和400μg/mL，分别作用于离心（3 000 r/min,15min），沉淀用无水乙醇洗涤2次，乙A549细胞，提取RNA，反转录为cDNA，用相对荧光定量醚洗涤1次，真空干燥得紫茎泽兰多糖样品。PCR检测细胞因子IL-6、TNF-α、IFN-β和IFN-γ的以葡萄糖作标准曲线，用苯酚-浓硫酸分光光度法测醇mRNA表达情况。结果表明在200μg/mL时4种细

6、胞因子沉淀物中的EAP糖含量。的表达量都较高（P＜0.05）。3紫茎泽兰多糖对人源细胞和鼠源细胞的免疫调EAP终浓度分别为50 μg/mL、100μg/mL、200μg/节作用mL和400μg/mL，LPS对照的浓度为50 ng/mL，PBS组3.1多糖的处理为阴性对照。从图1中可以看出，IL-6、TNF-α、IFN-β1）将提取的紫茎泽兰多糖溶于蒸馏水中，经0.45 μm和IFN-γ在EAP浓度为200 μg/mL时其mRNA的表达和0.22μm的过滤器过滤，用细胞培养液稀释；都显著提高（P＜0.05）。EAP浓度200μg/mL与其他浓度2)将T25细胞培养瓶培养的人源（A549）细

7、胞和鼠相比提高效果最明显。源（RAW264.7）细胞经胰酶消化后加入细胞培养液使其4.1.2不同时间点EAP对A549细胞的影响最终体积为20 mL，向6孔培养液中加入2 mL/孔，同实验选取了紫茎泽兰多糖浓度为200 μg/mL，分别作时加入紫茎泽兰多糖溶液200 μL/孔，使其最终浓度为用时间12 h、24 h和36 h于A549细胞，提取RNA，反54猪业科学  SWINE INDUSTRY SCIENCE  2014年 第1