紫茎泽兰主要毒素euptox a的提取及其生物活性初步研究

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1、万方数据论文独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取得的成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，学位论文中不包含其他个人或集体己经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川农业大学或其它教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签加僻多月多日关于论文使用授权的声明本人完全了解四川农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和

2、借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意17771711农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。口本论文不保密。口本论文保密，在一年解密后适用本授权。(请在以上口内划“4”)研究生签导师签矽，噼占月岁日印c甲年6月“万方数据四川农业大学2014届硕士学位论文摘要紫茎泽兰(EupatoriumaderwphorumSpreng或AgeratinaadenophoraSpreng)大约于40年代从中缅边境传入云南省，现已在云南、四川、贵州、广西和西藏有广泛的分布，已成为危

3、害我国最为严重的外来入侵物种之一。对本地植物带来灾难性的危害，给畜牧业带来不可估量的损失，同时破坏了生态平衡，目前尚无有效的防除方法。本试验旨在从紫茎泽兰中提取主要毒素9．羰基．10，11．去氢泽兰酮(euptoxA)，构建一种高效快速的提取方法；研究euptoxA的杀螨活性、抗肿瘤活性，以期能筛选出紫茎泽兰主要毒素的有益生物活性，为探索紫茎泽兰新生源奠定理论基础，同时也为寻找防治、利用紫茎泽兰的新方法提供依据。其研究内容如下：1．紫茎泽兰主要毒素euptoxA的提取、分离及纯化流程：甲醇超声提取，乙酸乙酯萃取，硅胶柱层

4、析，薄层色谱法(TLC)初步筛选，上D101大孔树脂柱洗脱，粗品反复硅胶柱层析。高效液相色谱检测，结果表明euptoxA提取样品其纯度可达到98％以上。2．采用互补双对数(CLL)模型分析euptoxA对兔痒螨和兔疥螨的体外毒性。结果显示：euptoxA对兔痒螨和兔疥螨都有很强的杀灭效果。EuptoxA在浓度3mg／mL和4mg／mL时在4h内能够杀死所有的疥螨，而在4mg／mL时也可在4h内杀死所有的兔痒螨。在euptoxA浓度为2mg／mL、3mg／mL和4mg／mL时对兔疥螨的半数致死时间(LTso)分别为0．68

5、7h、O．526h、O．326h。EuptoxA浓度为3mg／mL和4mg／mL时对兔痒螨的LTs0分别为0．693h和0．493hoEuptoxA在2h内兔疥螨和兔痒螨的半数致死浓度(LCs0)分别为1．068mg／mL、0．902mg／mL。结果表明，euptoxA具有较强的杀螨活性，有潜力作为动物杀螨的新药物。3．采用MTT比色法测定euptoxA体外抗肿瘤活性，以人肺腺癌细胞系A549、人宫颈癌细胞系HeLa和人喉表皮癌细胞系Hep．2为靶细胞，并采用膜联蛋白V-FITC／PI双染色法用流式细胞仪和荧光定量PCR

6、测定HeLa细胞凋亡周期及相关凋亡基因的表达。结果显示：euptoxA对体外培养的三株肿瘤维胞都有不同程度的抑制作用。不同euptoxA浓度(O．25mg／mL、O．5mg／mL、1mg／万方数据四川农业大学2014届硕j仁学位论文mL和2mg／mL)对三三株肿瘤细胞的抑制作用差异恩著(P<0．05或P<0．01)。随着浓度的增加抑制率增加，对A549、HeLa和Hep一2三株肿瘤细胞系的半数抑制浓度(ICs0)分别为369}tg／mL、401gg／mL和427gg／mL。流式细胞仪检测结果显示：euptoxA处理组处于

7、S期的细胞数量与阴性对照组比较差异性显著(P<0．05或P<0．01)，并呈一定的量效关系，说明euptoxA阻滞细胞于S期，使HeLa细胞发生S阻滞的生物学效应，从而起到抗肿瘤作用。荧光定量PCR结果显示：euptoxA能促进HeLa细胞中caspase一10mRNA表达上调，但不呈现剂量依赖性，随着euptoxA剂量增加，caspase。10mRNA表达量表现为先增加、后减少，在质量浓度30p．g／mL时，caspase．10mRNA表达量最大，为对照组mRNA表达量的4．12倍，但不同浓度的euptoxA对casp

8、ase一3mRNA表达量与对照组相比无显著差异(P>0．05)。关键词：紫茎泽兰；9．羰基．10，11．去氢泽兰酮；提取；杀螨活性；抗肿瘤活性II万方数据四川农业大学2014届硕士学位论文StudyonExtraction，IsolationandBiologicalActivityofeuptoxAfromEupa