T∕CI 004-2022 高麦黄酮小麦籽粒中游离态麦黄酮及总麦黄酮含量指标和测定方法

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ICS67.060CCSB21!"#$!"#$%%&'(%(()*+,-*./0123*+,45*+,6789:;<=>Contentindexanddeterminationmethodoftricinandtotalwheatflavonoidinhighwheatflavonoidvariety全国团体标准信息平台(%((?(?@AB(%((?(?@CD0EEFGHIJKAB

1!"#$%%&'(%((LMNO..................................................................................................................................................................................................................................2PO..................................................................................................................................................................................................................................3QRS...............................................................................................................................................................................................................................42TRUPVWX......................................................................................................................................................................................................43YZ4<[................................................................................................................................................................................................................43.1游离态⻨⻩酮...................................................................................................................................................................................................43.2总⻨⻩酮.............................................................................................................................................................................................................43.3⾼⻨⻩酮⼩⻨...................................................................................................................................................................................................54\;=>.....................................................................................................................................................................................................................54.1⼩⻨籽粒中⻨⻩酮含量的测定⽅法......................................................................................................................................................54.1.1原理...................................................................................................................................................................................................................54.1.2试剂...................................................................................................................................................................................................................54.1.3溶液配制.........................................................................................................................................................................................................54.1.4标准溶液配制...............................................................................................................................................................................................54.1.5仪器和设备....................................................................................................................................................................................................54.1.6试样制备与保存..........................................................................................................................................................................................64.1.7准备步骤.........................................................................................................................................................................................................64.1.8测定...................................................................................................................................................................................................................64.1.9平⾏试验.........................................................................................................................................................................................................84.1.10空⽩试验.......................................................................................................................................................................................................84.1.11结果计算和表述........................................................................................................................................................................................84.1.12精密度............................................................................................................................................................................................................84.1.13定量限和回收率........................................................................................................................................................................................94.2总⻩酮含量的测定⽅法...............................................................................................................................................................................94.2.1原理...................................................................................................................................................................................................................94.2.2试剂和材料....................................................................................................................................................................................................94.2.3溶液配制.........................................................................................................................................................................................................94.2.4标准溶液配制...............................................................................................................................................................................................94.2.5仪器和设备....................................................................................................................................................................................................94.2.6标准曲线的制作........................................................................................................................................................................................104.2.7试样制备与保存........................................................................................................................................................................................104.2.8准备步骤.......................................................................................................................................................................................................104.2.9结果计算和表述........................................................................................................................................................................................104.2.10精全国团体标准信息平台密度..........................................................................................................................................................................................................101

2!"#$%%&'(%((NO本⽂件按照GB/T1.1-2020《标准化⼯作导则第1部分：标准化⽂件的结构和起草规则》起草。某些内容可能涉及专利，本⽂件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本⽂件由中国国际科技促进会标准化⼯作委员会提出。本⽂件由中国国际科技促进会归⼝。本⽂件起草单位：⼭东国仓健⽣物科技有限公司，⼭东华⽥农业科技有限公司，⼭东农业⼤学，泰安市农业科学院，解放军总医院普通外科学部，⼭东天泽泰⽥种业科技有限公司，莱州宏源⾯粉有限公司，泰安市⾕⾹园⻝品有限公司。本⽂件主要起草⼈：胥倩、⽥纪春、刘振、王群⻘、王⻄振、邓志英、于海霞、彭莉、郑铮、由佳辉、⽥磊，杨明、王延训、赵善仓、吕⺠全、谢秀伦。本⽂件为⾸次发布，今后将根据⾼⻨⻩酮⼩⻨的社会需求和游离态⻨⻩酮及总⻨⻩检测技术发展情况适时修订。全国团体标准信息平台2

3!"#$%%&'(%((PO随着社会经济发展，全球农业研究热点也聚于探寻农业、营养、健康的关系，农作物品种也有了新需求。2017年国家《主要农作物品种审定标准》（国品审【2017】1号）次在⾼产品种、绿⾊优质品种之后提出特殊⽤途品种的新类型，使我国的农作物育种导向发⽣了重⼤变，作为殊⽤途品种类型的功能性⼩迎来了所未有的发展机遇。⾼⻩酮⼩新品种就是⼀种⾮常重要的特殊⽤途功能⼩。⻩酮类物质属多酚类合物，具有扩张⾎管、抗菌消炎和增强⼈体免疫⼒等多重功。⽇常⻝中摄⼊的⻩酮类合物能减少症和⼼脏病等疾病的发病率。近年来，国内外多个研究团队开展了⾼⻩酮⼩的育种、鉴定技术研究。⼭农业⼤学⼩品质育种团队，以赵善仓博⼠（2003届）论⽂为标志，开始了⼩⻩酮⽅⾯的研究。经近20年攻关，于2020年育成我国⼀个审定的⾼⻩酮⼩新品种⼭农101（鲁审20206035），总⻩酮含量1.013mg/kg，新华社、科技⽇报等媒体均已“国内⼀个功能性⼩品种通过审定”进⾏了报道。国内外⾄今仍没有⾼⻩酮⼩品种的定义和⻩酮含量指标，其检测⽅法也⽆统⼀标准。因此，本标准对游离态⻩酮、总⻩酮及⾼⻩酮⼩的术语、定义、围和⼩籽粒中游离态⻩酮及总⻩酮含量指标进⾏科学确定，对⼩籽粒及制品中游离⻩酮和总⻩酮的测定⽅法进⾏统⼀规，有利于培育更好的⾼⻩酮⼩新品种。在满⾜⼈⺠群众对⽣活质量和健康⽔平的新需求，确我国营养导向型农业的健康发展⽅⾯具有重⼤意义。全国团体标准信息平台3

4!"#$%%&'(%(()*+,-*./0123*+,45*+,6789:;<=>QRS本⽂件规定了游离态⻨⻩酮、总⻨⻩酮、⾼⻨⻩酮⼩⻨的术语、定义和游离态⻨⻩酮含量、总⻨⻩酮含量指标及其检测⽅法。本⽂件适⽤于⼩⻨籽粒中游离态⻨⻩酮及总⻨⻩酮含量的定量测定。企业在制定企业标准时可参照使⽤，相关机构在选育、审定和应⽤⾼⻩酮⼩⻨及其制品时可参照使⽤。(TRUPVWX下列⽂件中的内容通过⽂中的规范性引⽤⽽构成本⽂件必不可少的条款。其中，注⽇期的引⽤⽂件，仅该⽇期对应的版本适⽤于本⽂件；凡是不注⽇期的引⽤⽂件，其最新版本（包括所有的修改单）适⽤于本⽂件。GB/T6682分析实验室⽤⽔规格和试验⽅法GB/T603化学试剂试验⽅法中所⽤制剂及制品的制备GB1351⼩⻨GB/T1355⼩⻨粉GB/T6041质谱分析⽅法通则GB/T16631⾼效液相⾊谱法通则GB/Z35959液相⾊谱-质谱联⽤分析⽅法通则GB/T20574蜂胶中总⻩酮含量的测定⽅法分光光度⽐⾊法]YZ4<[3.1123*+,Tricin游离全国团体标准信息平台态⻨⻩酮，⼜称⻨⻩酮、苜蓿素、⼩⻨⻩素，化学名称为5,7,4’-三羟基-3’,5’-⼆甲氧基⻩酮。游离态⻨⻩酮具有较强的抗氧化能⼒，能够调节⼼⾎管功能，抑制癌细胞⽣⻓，延迟⾃发性乳腺肿瘤的发⽣。3.25*+,Totalwheatflavonoid4

5!"#$%%&'(%((总⻨⻩酮，即⼩⻨中⻩酮类物质的总含量。⻩酮类物质属多酚类化合物，是两个苯环通过三个碳原⼦相互连接⽽成的⼀系列化合物的总称，包含游离态⻨⻩酮、⻩酮苷元及糖苷衍⽣物。⻩酮类物质具有很强的抗氧化和清除⾃由基的能⼒，同时具有改善⼼⾎管疾病症状、抗癌抗肿瘤、抗菌抗炎、增强⼈体免疫⼒等多重功效。3.3)*+,-*Highflavonoidwheat在⼩⻨⽣⻓发育过程中，籽粒中⾃然产⽣和积累的游离态⻨⻩酮含量⼤于0.5mg/kg（含）或者总⻨⻩酮含量⼤于1mg/kg（含）的⼩⻨品种（不含⿊、紫、蓝等彩⾊⼩⻨）。&\;=>4.1-*./0*+,67的;<=>)效^相⾊_-串`a_>4.1.1原理试样⽤80%⼄醇溶液提取，经离⼼浓缩后复溶，⽤液相⾊谱串联质谱仪检测，外标法定量。4.1.2试剂除另有规定外，⽔应符合GB/T6682中规定的⼀级⽔。4.1.2.1⼄醇(CH3CH2OH，CAS号：64-17-5)：⾊谱纯。4.1.2.2甲醇(CH3OH，CAS号：67-56-1)：⾊谱纯。4.1.2.3甲酸(HCOOH，CAS号：64-18-6)：⾊谱纯。4.1.2.4标准品(⻨⻩酮，Tricin，520-32-1)：纯度≥95.0％。4.1.3溶^配制4.1.3.180%⼄醇溶液：取800mL⼄醇，加⼊200mL⽔，摇匀备⽤。4.1.3.20.1%甲酸溶液：取1000mL⽔，加⼊1mL甲酸，摇匀备⽤。4.1.49准溶^配制4.1.4.1标准储备溶液分别称取5mg标准物质于10mL容量瓶中，⽤甲醇溶解并定容⾄刻度，标准溶液避光-40℃保存，保存期为⼀年。4.1.4.2材料微孔过滤膜（尼⻰）：0.22µm。4.1.5仪器全国团体标准信息平台:设备4.1.5.1液相⾊谱-串联质谱仪：配有电喷雾离⼦源(ESI)。4.1.5.2离⼼管：2mL。5

6!"#$%%&'(%((4.1.5.3分析天平：感量0.1mg。4.1.5.4移液器：1mL。4.1.5.5震动球磨仪。4.1.5.6样品瓶：2mL，带聚四氟⼄烯旋盖。4.1.5.7涡旋混合器。4.1.5.8氮⽓吹⼲仪。4.1.5.9⾼速离⼼机：13000r/min。4.1.5.10超声波清洗仪。4.1.6试样制备与保存⼩⻨籽粒使⽤震动球磨仪磨碎，密封并标明标记。将试样置于-80℃冰箱保存。4.1.7准备步骤称取100mg试样(精确⾄0.01g)2mL离⼼管中，加⼊1mL80%⼄醇⽔溶液，在涡旋混合器上涡旋2min，超声处理40min，置于旋转混匀仪上混匀8h，13000r/min离⼼5min，取全部上清液⾄另⼀⼲净离⼼管中，再加⼊1mL甲醇，超声40min，13000r/min离⼼5min，合并两次上清液，在氮⽓吹⼲仪上常温吹⼲，加⼊100µL甲醇复溶，0.22µm滤膜过滤后供液相⾊谱串联质谱仪检测。4.1.8;<4.1.8.1液相⾊谱-串联质谱参考条件a)⾊谱柱：HypersilGoldC18,3.5µm,100mm×2.1mm（内径）或相当者；b)流动相及梯度洗脱条件⻅表1；b1流动相4梯度洗脱条X步骤总时间（min）流速（µL/min）流动相A（0.1%甲酸⽔/％）流动相B（甲醇/％）10300901020.230090103630010904830010905全国团体标准信息平台8.130090106103009010c)柱温：35℃；6

7!"#$%%&'(%((d)进样量：5µL；e)电离源模式：电喷雾离⼦化；f)电离源极性：负离⼦模式；g)雾化⽓：氮⽓；h)离⼦喷雾电压：2500V；i)雾化⽓温度：317℃；j)离⼦传输管温度：333℃；k)监测离⼦对及碰撞⽓能量⻅表2。b2监;2⼦对4碰撞⽓能7中⽂名称英⽂名称保留时间（min）定量离⼦定性离⼦碰撞能量（V）⻨⻩酮Tricin5.67329.1/299329.1/299；329.1/314.125；194.1.8.2定性测定在相同实验条件下进⾏样品测定时，如果检出的⾊谱峰的保留时间与标准样品相⼀致，在扣除背景后的样品质谱图中，所选择的离⼦均出现，且所选择的离⼦丰度⽐与标准样品的离⼦丰度⽐相⼀致（相对丰度＞50%，允许±20%偏差；相对丰度＞20%⾄50%，允许±25%偏差；相对丰度＞10%⾄20%，允许±30%偏差；相对丰度≤10%，允许±50%偏差），则可判断样品中存在⻨⻩酮。4.1.8.3定量测定本⽂件中液相⾊谱串联质谱采⽤外标-校准曲线法定量测定。为减少基质对定量测定的影响，定量⽤标准溶液应采⽤基质混合标准⼯作溶液绘制标准曲线。并且保证所测样品中农药及相关化学品的响应值均在仪器的线性范围内。⻨⻩酮标准品液质联⽤谱图如图1所示。全国团体标准信息平台c1*+,^a`V_c7

8!"#$%%&'(%((4.1.9平⾏试d按以上步骤对同⼀试样进⾏平⾏试验。4.1.10空⽩试d除不称取试样外，均按上述步骤进⾏。4.1.11结果计算:b述液相⾊谱-串联质谱测定采⽤标准曲线法定量，标准曲线法定量结果按公式（1）计算式中：…………………（1）Xi——试样中被测组分含量，单位为毫克每千克(mg/kg)；ci——从标准曲线上得到的被测组分溶液浓度，单位为微克每毫升(µg/mL)；V——样品溶液定容体积，单位为毫升(mL)；m——样品溶液所代表试样的重量，单位为克(g)。4.1.12精密度4.1.12.1在重复性条件下获得的两次独⽴测定结果的绝对差值与其算术平均值的⽐值（百分率），应符合表3的要求。b3Cde内重复Ufg被测组分含量（mg/kg）精密度（%）≤0.00136＞0.001，≤0.0132＞0.01，≤0.122＞0.1，≤118＞1144.1.12.2在再现性条件下获得的两次独⽴测定结果的绝对差值与其算术平均值的⽐值（百分率），应符合表4的要求。b4CdehijUfg全国团体标准信息平台被测组分含量（mg/kg）精密度（%）0.00154＞0.001，≤0.01468

9!"#$%%&'(%((＞0.01，≤0.134＞0.1，≤125＞1194.1.13<7限:回收率4.1.13.1定量限本⽅法的定量限LOQ(LimitofQuantity，LOQ)为4µg/g。4.1.13.2回收率当添加⽔平为LOQ、4×LOQ时，添加回收率分别为84%和79%。4.25+,67的;<=>分光光度⽐⾊>4.2.1原理试样⽤⼄醇溶液提取后，溶于⼄醇的⻩酮类物质与铝离⼦显⾊剂结合，形成有⾊物质，在510nm波⻓附近产⽣最⼤吸收，⼀定浓度范围内，吸光度与总⻩酮含量成正⽐，通过与标准曲线⽐对获得总⻩酮含量。4.2.2试剂:材料除另有规定外，⽔应符合GB/T6682中规定的⼀级⽔。4.2.2.1硝酸铝(Al(NO3)3·9H2O)：分析纯。4.2.2.2亚硝酸钠(NaNO₂)：分析纯。4.2.2.3氢氧化钠(NaOH)：分析纯。4.2.2.4芦丁(C27H30O16，CAS号：153-18-4)，纯度≥99.0％。4.2.3溶^配制4.2.3.160%⼄醇溶液：取600mL⼄醇，加⼊400mL⽔，摇匀备⽤。4.2.3.210%硝酸铝溶液：称取10g硝酸铝，加⽔定容到100mL。4.2.3.35%亚硝酸钠溶液：称取5g亚硝酸钠，加⽔定容到100mL。4.2.3.44%氢氧化钠试液：称取4g氢氧化钠，加⽔定容到100mL。4.2.49准溶^配制称量全国团体标准信息平台13.2mg芦丁，⽤60%⼄醇定容到25mL容量瓶作为标准溶液储备液。4.2.5仪器:设备4.2.5.1可⻅分光光度计。4.2.5.2分析天平：感量0.1mg。9

10!"#$%%&'(%((4.2.5.3震动球磨仪。4.2.5.4涡旋混合器。4.2.5.5⾼速离⼼机：9500r/min。4.2.5.6超声波清洗仪。4.2.69准曲线的制作准确吸取0mL、0.4mL、0.8mL、1.2mL、1.6mL、2.0mL芦丁标准溶液，放⼊10mL容量瓶内（写明标记），分别加⼊2.0mL、1.6mL、1.2mL、0.8mL、0.4mL、0mL的60%⼄醇溶液；再加⼊5%亚硝酸钠溶液0.5mL摇匀，放置6min；加⼊10%硝酸铝溶液0.5mL，放置6min后；加⼊4%氢氧化钠溶液4.0mL，加60%⼄醇定容，摇匀后，放置15min；以不加芦丁对照品溶液为空⽩，采⽤分光光度法在510nm波⻓处测定吸光度，以芦丁浓度(mg/mL)为横坐标，吸光度(A)为纵坐标，绘制标准曲线。4.2.7试样制备与保存⼩⻨籽粒使⽤震动球磨仪磨碎，密封并标明标记。将试样置于-80℃冰箱保存。4.2.8准备步骤称取1g试样（精确⾄0.01g）于15mL离⼼管中，加⼊10mL60%⼄醇溶液，混匀，超声处理60min，期间每20min摇匀溶液⼀次，9500r/min离⼼10min，将上清液转移⾄25mL容量瓶，加⼊5%亚硝酸钠溶液0.5mL，加⼊10%硝酸铝溶液0.5mL，加4%氢氧化钠溶液4mL，⽤60%⼄醇定容⾄刻度，摇匀后放置15min，以不加样品液为空⽩，摇匀后⽤5cm的⽐⾊⽫，在510nm处测定吸光度。4.2.9结果计算:b述总⻩酮含量（⼲基）按芦丁质量分数计，按公式（2）进⾏计算：…………………（2）ω——总⻩酮含量；m——由标准曲线上查得样品溶液中芦丁质量，单位为毫克(mg)；W——样品的质量，单位为克(g)；d——稀释⽐例。计算结果表示到⼩数点后两位。4.2.10精密全国团体标准信息平台度在重复性条件下获得的两次独⽴测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10％。10

11!"#$%%&'(%((全国团体标准信息平台11