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内容药敏试验的常用方法及应用抗真菌药物的耐药监测现状抗真菌药物的耐药机制研究近况
1抗真菌药物的种类麦角固醇多烯类如两性霉素B唑类如氟康唑伊曲康唑伏立康唑泊沙康唑核苷类如5-氟胞嘧啶角鲨烯羊毛甾醇K+Mg2+丙烯胺类如特比萘芬乙酰辅酶A棘白菌素类如卡泊芬净米卡芬净安尼芬净尼可霉素核酸合成葡聚糖合成甲壳质合成
2侵袭性真菌感染逐渐增多念珠菌－院内感染第４位的病原菌曲霉－第2位的病原真菌接合菌(毛霉)隐球菌
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5药敏试验的作用评价新型抗真菌药物的体外抗菌活性，开发新药;检测临床病原真菌对不同抗真菌药物的体外敏感性;指导临床用药的选择,监测疗效,发现耐药株.
6药敏试验测定方法液基稀释法—CLSIM27-A3，M38-A2琼脂稀释法纸片扩散法—CLSIM44-A2E－test法,ATBFungus2,3联合用药：棋盘法棘白菌素类
7标准化的药敏方法日趋成熟CLSI（NCCLS)制定的标准被普遍接受M27－A3酵母菌肉汤稀释法体外抗真菌药敏试验参考方法_棘白菌素类折点M38－A2丝状真菌肉汤稀释法体外抗真菌药敏试验参考方法_新质控株、皮肤癣菌M44－A2酵母菌纸片扩散法抗真菌药敏试验EUCAST标准（EuropeanCommitteeforAntibioticSusceptibilityTesting）与CLSI取得一致
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9酵母菌药敏试验建立了对以下药物的测定方法:氟康唑、伊曲康唑、5-FC、两性霉素B、伏立康唑;体外-体内疗效关系已初步建立,特别对氟康唑;已提出判定折点及其解释.
10丝状真菌药敏试验产孢菌种已建立方法;针对目前临床常用药物(棘白菌素);但尚未建立折点;体外–体内的一致性尚在探讨中;检测烟曲霉菌对唑类药物的敏感性有意义;两性霉素B解释仍然困难;详细鉴定到种水平是必要的;如土曲霉,尖端赛多孢子菌,和多育赛多孢一般对两性霉素B耐药.
11Etest和其它商品化方法优点:使用简便；对酵母菌比较稳定,丝状菌尚在研究中；与CLSI方法有较高一致性；但对唑类的MICs常由于存在拖尾难以判断；其它的快速检测试剂尚需进一步验证,如ROSCO纸片法。
12判断抗真菌药的敏感性和耐药性CLSI方案测定念珠菌体外敏感试验折点MIC（μg/ml）敏感S剂量依赖性敏感SDD中介I耐药R氟康唑<=816-32->=64伊曲康唑*<=0.1250.25-0.5->1氟胞嘧啶<=4-8-16>32伏立康唑<=12->=4*数据主要基于粘膜疾病
13M-44A方案测定念珠菌体外敏感试验折点抑菌菌直径（mm）敏感S剂量依赖性敏感SDD耐药R氟康唑Fluconazole>=1915-18<=14伏立康唑Voriconazole>=1714-16<=13
14药敏试验的应用指征尽可能将临床分离株鉴定到种；意义：曲霉中敏感性不同，土曲、新种↓无菌部位的念珠菌，常规做氟康唑和5-FC药敏；黏膜感染，治疗失败后应行药敏；天然耐药者不测.
15内容药敏试验的常用方法及应用抗真菌药物的耐药监测现状抗真菌药物的耐药机制研究近况
16ARTEMISDISK药敏监测—来自全球40个国家134个研究点氟康唑:205,329株酵母菌(1997至2005)；伏立康唑:147,776株酵母菌(2001至2005)；方法：CLSIM44-A纸片扩散法结果：BIOMIC图象分析系统自动判读。Pfalleretal.JClinMicrobiol2007,Vol.45,P.1735-45
17ARTEMISDISK监测结果90.1%的念珠菌株对氟康唑敏感，22个种中有10个种出现敏感性降低(敏感度<75%)，对氟康唑耐药的种主要为光滑念珠菌和克柔念珠菌。94.8%的念珠菌对伏立康唑敏感，3.1%耐药。对氟康唑耐药的白念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌和皱落念珠菌菌株中对伏立康唑保持敏感的比例不足30%。非念珠菌酵母菌(8,821株)，对氟康唑不敏感，除红酵母菌对伏立康唑敏感。本研究证实了唑类药物对临床最常见酵母菌的广谱抗菌活性，但也发现一些少见酵母菌的敏感性下降。Pfalleretal.JClinMicrobiol2007,Vol.45,P.1735-45
18念珠菌血症病原菌的药敏China-Scan项目：2009年11月至2011年4月，全国63家医院67个ICU病房共同参加，249例念珠菌血症了解我国ICU患者中侵袭性念珠菌血症病原菌的体外药物敏感性特征
19判断抗真菌药的敏感性和耐药性MIC（μg/ml）敏感S剂量依赖性敏感SDD中介I耐药R氟康唑<=816-32->=64伊曲康唑*<=0.1250.25-0.5->1氟胞嘧啶<=4-8-16>32伏立康唑<=12->=4*数据主要基于粘膜疾病TheCLSIbreakpointforechinocandins=2µg/ml
20药敏试验结果（MIC90）菌种/药物FLC（µg/ml）ITC（µg/ml）VRC（µg/ml）CAS（µg/ml）C.a820.250.5C.p1620.51C.t820.50.5C.gl64420.5C.h32411others3220.51
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24%μg/ml%
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27Fluconazole不敏感念珠菌对Voriconazole的药敏数据PfallerMA,JCM,2010,48(4):1366–1377唑类交叉耐药比例升高全球念珠菌监测体外药敏数据(1997-2007)
28荷兰伊曲康唑耐药菌比例有所上升Year%RNSneldersetal.PLoSMedicine.2008;5:e219.L98H(TR)wasthedominantresistancemechanismIsolatesgeneticallydistinctbutclustered.
29曲霉临床菌株的分离鉴定来源：北大医院皮科真菌室受检标本时间：2008年7月到2011年11月鉴定：所有菌株均经标准的曲霉鉴定方法进行鉴定，即在麦芽琼脂和查氏琼脂平皿25度培养7天后，经形态学鉴定（据齐祖同主编《中国真菌志-第5卷：曲霉属及其相关有性型》，科学出版社，1997年）菌种分布：烟曲霉130株，黄曲霉58株，土曲霉16株，其它9株
30药物敏感性测定及结果测定方法：CLSIM38-A方案和E-试验结果1株烟曲霉对ITC耐药而对VRC敏感1株烟曲霉对ITC和VRC均耐药1株黄曲霉对VRC耐药而对ITC敏感
31内容药敏试验的常用方法及应用抗真菌药物的耐药监测现状抗真菌药物的耐药机制研究近况
32什么情况下容易发生耐药?P.Verweij,TIMM,2007
33常见耐药菌及其类型真菌AmB5-FC唑类棘白菌素C.glabrata获得性—获得性—C.krusei获得性天然天然—C.lusitaniae天然/获得性———Cryptococcusneoformans———天然Aspergillusterreus天然———Scedosporiumapiospermum天然———Scedosporiumprolificans天然———Trichosporonbeigelii天然———
34ERG11基因突变ERG11基因过表达ERG3、ERG5基因突变药物泵基因过表达念珠菌唑类药物耐药机制ClinMicrobiolRev1998;11:382
35烟曲霉菌耐药机制ChamilosG,KontoyiannisDP.,DrugResistanceUpdates8(2005)344–358
36AF1，2001年12月，第一次就诊；AF2，2002年6月，ICZ200mg/d治疗6个月后；AF3，2002年8月，停药2个月以后；ICZ静脉给药，200mgbid治疗两周，然后口服，200mg/d继续治疗，其间分离到以下三株：AF4，2002年12月；AF5，2003年1月；AF6，2003年2月；烟曲霉唑类药物耐药系列分离株Chen&Li,etal.JAC,2005.
37MICofitraconazoleagainst6isolatesIsolateMIC(mg/L)AF10.25AF2>16AF30.5AF4>16AF5>16AF6>16
38AF2的CYP51A第220位蛋氨酸被异亮氨酸替代(M220I)AF4-6的CYP51A第54位的甘氨酸被精氨酸替代(G54R)
39药物流出泵及唑类药物靶酶基因相对表达水平
40MannP.A,etal.Antimicrob.AgentsChemother,2003,47:577-581.Diaz-GuerraT.M,etal.Antimicrob.AgentsChemother,2003,47:1120-1124NascimentoA.M,etal.Antimicrob.AgentsChemother,2003,47:1719-1726MelladoE.etal.Antimicrob.AgentsChemother,2004,48:2747-2750烟曲霉菌cyp51A基因突变的报道
41有关三唑类耐药的氨基酸替换氨基酸改变耐药药物M220I,M220V,M220K,M220T伊曲康唑G54R,G54E,G54K,G54V伊曲康唑和泊沙康唑L98H﹡伊曲康唑、泊沙康唑、伏立康唑和立福康唑﹡许多三唑类耐药是因为在CYP51A基因启动子L89H与2个拷贝的34bp片段串联相结合。
42药物主动外排泵的变化基因标志蛋白参考文献AfuMDR1ATP-结合盒超家族Tobin,M.B.etalgene1997AfuMDR2ATP-结合盒超家族AfuMDR3主要辅助因子超家族转运蛋白NascimentoA.M.etalAntimicrobAgentsChemother2003AfuMDR4ATP-结合盒超家族AtrFATP-结合盒超家族JohnW.Slavenetal.FungalGeneticsandBiology2002
43UpdateonazoleresistanceinAspergillusfumigatus
44曲霉与唑类Invitro“reducedsusceptibility”remains0-5%inmostlargesurveys,oftenusingitraconazoleMostdataforA.fumigatussectionCasereportsandcaseseriessuggestthatmultiply-azoleresistantAspergilluscouldemerge?associationwithagriculturalazoleuseRodriguez-Tudela,etal.AntimicrobAgentsChemother.2008;52:2468.Verweij,etal.NEnglJMed.2007;356:1481-83.Arendrup,etal.AntimicrobAgentsChemother.2008;52:3504-11.Howard,etal.IntJAntimicrobAgentsChemother.2006;28:450-53.Sneldersetal.PLoSMedicine.2008;5:e219.
45唑类药物对曲霉的流行病学折点ECV(µg/mL)ITRPSCVRCSpeciesNo.TestedA.fumigatus281510.251A.flavus59210.51A.niger520212A.terreus46220.51Espinel-Ingroffetal.JCM.2010;submitted.
46DevelopmentofAzoleresistanceofA.fumigatusP.Verweij,TIMM,2007
47耐药曲霉感染的病例报告（1）女性，10岁，急淋，在化疗过程中出现高热；给予头孢匹胺等抗细菌、氟康唑预防真菌感染处理；肺部CT检示：肺内结节灶；痰液真菌镜检示：分支分隔的菌丝，培养示烟曲霉，故改用伏立康唑；治疗9天后，体温38.1度，咳嗽减轻；继续治疗一周后复查CT见肺脏病变减轻不明显，故而给予AMB，20mg/d，一周后无发热、咳嗽，肺内病变未扩大；继续治疗一周后无明显症状，CT示肺内结节局限，故停用AMB而出院。
48临床菌株及药物敏感性特点（1）菌株ITCVRCAMBCASAF2930.5110.2504787-１≥16810.504787-２≥16210.25RepeatnumbersofmicrosatellitelociAllelicprofileeSTAf3AAf3BAf3CAf4AAf4BAf4CANX4BGT1CAT1LIPMAT12SODBZRF2318579192141111322985791921311119
49烟曲霉唑类药物耐药机制（2）菌株ITC（mg/L）VRC（mg/L）Cyp51A突变04787（1）≥168TR/L98H，Y46F、V172M、T248N、E255D、K427E，L307P04787（2）≥162TR/L98H，Y46F、V172M、T248N、E255D、K427E，F495I、S297T、L190PAF2>161M220IAF4,AF5,AF6>160.5-1G54R未见以往的G54、M220、G448、G138（后二者与ITC及VRC交叉耐药相关）Y46F、V172M、T248N、E255D、K427E:文献报告与耐药无关TR/L98H:导致ITC耐药、VRC中度敏感；故L190P与耐药无关，而L307P的作用需阐明Qiao,2008；Mellado,2007；Howard,2006；Kontoyiannis,2005；Evelline,2008
50小结体外药物敏感性结果与方法有关—需要统一和规范；长期监测意义重要—菌种动态变化和耐药监测；可以作为临床经验用药的依据；当治疗效果不满意时应考虑做体外药敏试验；对于有耐药可能的菌株应及时做药敏试验；警惕获得性耐药的发生—白念、烟曲霉等。
51联系方式:lry0660@gmail.com,83573056谢谢大家!
